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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR电泳图求助。。
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liulugang

木虫 (小有名气)

[求助] PCR电泳图求助。。

分子新手，最近做的PCR，为什么总是扩增出这样的条带？这是什么都木有扩增出来吗？

IMG_0003.JPG
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1楼 2013-05-06 21:34:52
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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liulugang: 金币+1 2013-05-07 14:27:17
请提高退火温度.特异性条带过多造成
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2楼2013-05-06 22:58:25
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冰封之real

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liulugang: 金币+2 2013-05-07 14:27:00
我也遇到过类似情况。一般原因就是非特异性扩增，也就是说你的引物不好用。如果你P的是菌液，还有可能是菌液过浓，蛋白含量太高。还用一种可能（比较低），你点样的时候loadingbuffer加的不够，样品没有沉到胶孔里，结果电泳的时候挂在孔上了。
顺便说一句，从你跑出的marker来看，这块胶做的不太均匀，琼脂糖明显没融好。
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3楼2013-05-07 09:38:53
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liulugang

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冰封之real at 2013-05-07 09:38:53
我也遇到过类似情况。一般原因就是非特异性扩增，也就是说你的引物不好用。如果你P的是菌液，还有可能是菌液过浓，蛋白含量太高。还用一种可能（比较低），你点样的时候loadingbuffer加的不够，样品没有沉到胶孔里， ...

我做的是57-66的梯度，pcr。引物设计直接用的人家文献里的，扩增的是文献作者赠与的菌上的基因。
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4楼2013-05-07 14:24:35
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saimintc

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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liulugang: 金币+2, ★有帮助 2013-07-16 20:14:42
第三行最上面不是有一个条带么。
退火不用太在意TM值，一般55度都可以的。（做点突变pcr的primer的tm值普遍75以上，也照样用55度无压力）
混合的时候在冰上混合，而且别怕麻烦多混几下。
循环数不要太高，一般循环数太高就出现这种拖带。
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5楼2013-05-07 15:06:10
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