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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

[求助] PCR有弥散带 已有1人参与

如图为我的PCR电泳图,前六个与后六个只有引物不同,前六个(从左到右)为不带酶切位点的引物,后六个为带酶切位点引物。前六个有目的带,如箭头所示,但是很弱,后六个全部为抹带。
pcr条件为:94                               1min
                  梯度退火(55-60)      30s
                  72                                140s     35个循环
目的片段大小约2500bp。
求教为什么会出现这么严重的弥散,为什么后六个只有弥散呢?很郁闷……
改怎样改进pcr条件呢?

IMG_0547GGG.jpg
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姥姥不疼,舅舅不爱
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

为什么没人来呢??求帮忙啊!
姥姥不疼,舅舅不爱
2楼2013-03-15 17:30:19
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

求关注啊!这PCR要P死我了啊~!
姥姥不疼,舅舅不爱
3楼2013-03-15 17:31:15
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小小树虫

银虫 (小有名气)

很有意思,(猜测下) 模板用量多少ng? 是不是菌落PCR?
4楼2013-03-16 22:42:07
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励应助! 2013-03-17 22:17:57
咆哮的白菜: 金币+5, 有帮助, 是模板的问题 2013-03-19 16:32:12
第一 你的不加酶切位点的引物扩出来的带也不够亮,可能是模板浓度不对或者纯度不够,或者退火温度不对。不知道你的引物有多长,引物长了可以继续提高退火。第二,换了带酶切位点的引物后扩不出来,可能是引物的问题,加了酶切位点后不好退火了,引物变长了,应该提高退火温度。你应该检查下你的模板。
5楼2013-03-17 15:06:13
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小小树虫 at 2013-03-16 22:42:07
很有意思,(猜测下) 模板用量多少ng? 是不是菌落PCR?

模板的量没有测,估计是模板浓度不够。不是菌落PCR。
姥姥不疼,舅舅不爱
6楼2013-03-18 08:45:21
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by yb19841014 at 2013-03-17 15:06:13
第一 你的不加酶切位点的引物扩出来的带也不够亮,可能是模板浓度不对或者纯度不够,或者退火温度不对。不知道你的引物有多长,引物长了可以继续提高退火。第二,换了带酶切位点的引物后扩不出来,可能是引物的问题 ...

退火温度从55-60都试了,估计是模板不行,换个模板再试试。
姥姥不疼,舅舅不爱
7楼2013-03-18 08:46:21
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


咆哮的白菜: 金币+1, 有帮助, 主要是看长相 2014-01-21 13:33:59
上样量太大也不行
8楼2014-01-21 09:28:19
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhang宇微 at 2014-01-21 09:28:19
上样量太大也不行

谢谢这位妹子把我一年前的帖子翻出来,让我好好怀念一下以前的PCR岁月,虽然你没说中问题根本(最后是落脚在模板量问题上),但是看在妹子这么敬业的态度上(其实主要是看长相),给分!
姥姥不疼,舅舅不爱
9楼2014-01-21 13:36:09
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 咆哮的白菜 at 2014-01-21 13:36:09
谢谢这位妹子把我一年前的帖子翻出来,让我好好怀念一下以前的PCR岁月,虽然你没说中问题根本(最后是落脚在模板量问题上),但是看在妹子这么敬业的态度上(其实主要是看长相),给分!...

。。不是的我是来看基因敲除的,我的长相怎么了!!!!!我也是有姿势的!!!!!!

[ 发自小木虫客户端 ]
10楼2014-01-21 19:41:27
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