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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】有用pfu的吗，求教
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陈思容

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】有用pfu的吗，求教 已有15人参与

这个学期开学来就一直在用高保真酶PCR,先用Taq做TD-PCR(65-50),35cycle,出来的条带很亮，可是用pfu在同样的反应条件下（延伸时间由1min改为2min）,却出不来条带，要么是前段的引物二聚体，要么是弥散带，反正就是不出来我要的带，实验进展因此耽搁了好多，望各位高手赐教，附图。
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1楼 2010-05-10 13:08:26
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霖希

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我以前在学校也遇到过类似的情况，是不是可以稍微改变一下退火温度？
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2楼2010-05-10 14:18:07
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biogefart

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):good！ 2010-05-12 08:15:44
pfu 的效率比taq低很多，我看你的产物也不是很长，taq的突变率不至于产生突变，还是用tag吧，
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闹太套
3楼2010-05-10 15:20:45
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miya173

银虫 (小有名气)
★
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仔细看看pfu的说明书啊，pfu的体系连加样顺序都跟其它的没不一样，taq一分钟可以扩2K，pfu是推荐按一分钟扩500bp计算。自己仔细看看吧。
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4楼2010-05-10 15:32:34
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
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正常，保真性高了效率会低的，可以尝试用taq plus，保真性也不错
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
5楼2010-05-10 15:32:43
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 霖希 at 2010-05-10 14:18:07:
我以前在学校也遇到过类似的情况，是不是可以稍微改变一下退火温度？

我试过提高到68，结果连二聚体也没了，跑胶一片空白，唉
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6楼2010-05-10 19:50:03
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by biogefart at 2010-05-10 15:20:45:
pfu 的效率比taq低很多，我看你的产物也不是很长，taq的突变率不至于产生突变，还是用tag吧，

我之前的几个序列都是用Pfu,中途换酶不太现实
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7楼2010-05-10 19:51:19
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by miya173 at 2010-05-10 15:32:34:
仔细看看pfu的说明书啊，pfu的体系连加样顺序都跟其它的没不一样，taq一分钟可以扩2K，pfu是推荐按一分钟扩500bp计算。自己仔细看看吧。

时间没问题，我再研究说明书吧，fermentas的酶
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8楼2010-05-10 19:52:06
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-05-10 15:32:43:
正常，保真性高了效率会低的，可以尝试用taq plus，保真性也不错

恩，我之前考虑过，还是用pfu比较好，就是很折磨人
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9楼2010-05-10 19:53:03
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yinsongna

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是不是GC含量太高了
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10楼2010-05-10 20:31:49
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