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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

[求助] PCR有弥散带 已有1人参与

如图为我的PCR电泳图,前六个与后六个只有引物不同,前六个(从左到右)为不带酶切位点的引物,后六个为带酶切位点引物。前六个有目的带,如箭头所示,但是很弱,后六个全部为抹带。
pcr条件为:94                               1min
                  梯度退火(55-60)      30s
                  72                                140s     35个循环
目的片段大小约2500bp。
求教为什么会出现这么严重的弥散,为什么后六个只有弥散呢?很郁闷……
改怎样改进pcr条件呢?

IMG_0547GGG.jpg
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姥姥不疼,舅舅不爱
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励应助! 2013-03-17 22:17:57
咆哮的白菜: 金币+5, 有帮助, 是模板的问题 2013-03-19 16:32:12
第一 你的不加酶切位点的引物扩出来的带也不够亮,可能是模板浓度不对或者纯度不够,或者退火温度不对。不知道你的引物有多长,引物长了可以继续提高退火。第二,换了带酶切位点的引物后扩不出来,可能是引物的问题,加了酶切位点后不好退火了,引物变长了,应该提高退火温度。你应该检查下你的模板。
5楼2013-03-17 15:06:13
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查看全部 11 个回答

咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

为什么没人来呢??求帮忙啊!
姥姥不疼,舅舅不爱
2楼2013-03-15 17:30:19
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

求关注啊!这PCR要P死我了啊~!
姥姥不疼,舅舅不爱
3楼2013-03-15 17:31:15
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小小树虫

银虫 (小有名气)

很有意思,(猜测下) 模板用量多少ng? 是不是菌落PCR?
4楼2013-03-16 22:42:07
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