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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

[求助] PCR有弥散带 已有1人参与

如图为我的PCR电泳图，前六个与后六个只有引物不同，前六个（从左到右）为不带酶切位点的引物，后六个为带酶切位点引物。前六个有目的带，如箭头所示，但是很弱，后六个全部为抹带。
pcr条件为：94                               1min
                  梯度退火（55-60）      30s
                  72                                140s     35个循环
目的片段大小约2500bp。
求教为什么会出现这么严重的弥散，为什么后六个只有弥散呢？很郁闷……
改怎样改进ｐｃｒ条件呢？

IMG_0547GGG.jpg
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姥姥不疼，舅舅不爱
1楼 2013-03-14 17:00:42
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
为什么没人来呢？？求帮忙啊！
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姥姥不疼，舅舅不爱
2楼2013-03-15 17:30:19
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
求关注啊！这PCR要P死我了啊~！
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姥姥不疼，舅舅不爱
3楼2013-03-15 17:31:15
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小小树虫

银虫 (小有名气)
很有意思，(猜测下) 模板用量多少ng？ 是不是菌落PCR?
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4楼2013-03-16 22:42:07
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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-03-17 22:17:57
咆哮的白菜: 金币+5, ★有帮助, 是模板的问题 2013-03-19 16:32:12
第一 你的不加酶切位点的引物扩出来的带也不够亮，可能是模板浓度不对或者纯度不够，或者退火温度不对。不知道你的引物有多长，引物长了可以继续提高退火。第二，换了带酶切位点的引物后扩不出来，可能是引物的问题，加了酶切位点后不好退火了，引物变长了，应该提高退火温度。你应该检查下你的模板。
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5楼2013-03-17 15:06:13
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小小树虫 at 2013-03-16 22:42:07
很有意思，(猜测下) 模板用量多少ng？ 是不是菌落PCR?

模板的量没有测，估计是模板浓度不够。不是菌落ＰＣＲ。
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姥姥不疼，舅舅不爱
6楼2013-03-18 08:45:21
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yb19841014 at 2013-03-17 15:06:13
第一 你的不加酶切位点的引物扩出来的带也不够亮，可能是模板浓度不对或者纯度不够，或者退火温度不对。不知道你的引物有多长，引物长了可以继续提高退火。第二，换了带酶切位点的引物后扩不出来，可能是引物的问题 ...

退火温度从５５－６０都试了，估计是模板不行，换个模板再试试。
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姥姥不疼，舅舅不爱
7楼2013-03-18 08:46:21
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
咆哮的白菜: 金币+1, ★有帮助, 主要是看长相 2014-01-21 13:33:59
上样量太大也不行
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8楼2014-01-21 09:28:19
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhang宇微 at 2014-01-21 09:28:19
上样量太大也不行

谢谢这位妹子把我一年前的帖子翻出来，让我好好怀念一下以前的PCR岁月，虽然你没说中问题根本（最后是落脚在模板量问题上），但是看在妹子这么敬业的态度上（其实主要是看长相），给分！
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姥姥不疼，舅舅不爱
9楼2014-01-21 13:36:09
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zhang宇微

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 咆哮的白菜 at 2014-01-21 13:36:09
谢谢这位妹子把我一年前的帖子翻出来，让我好好怀念一下以前的PCR岁月，虽然你没说中问题根本（最后是落脚在模板量问题上），但是看在妹子这么敬业的态度上（其实主要是看长相），给分！...

。。不是的我是来看基因敲除的，我的长相怎么了！！！！！我也是有姿势的！！！！！！

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10楼2014-01-21 19:41:27
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