应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建载体 待插入片段本身就是pcr凝胶回收产物 酶切后还需要再凝胶回收用于连接吗
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
101/1返回列表
查看: 4584  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

惰惰228

银虫 (小有名气)

[求助] 构建载体 待插入片段本身就是pcr凝胶回收产物 酶切后还需要再凝胶回收用于连接吗 已有4人参与

打算构建一个载体，待插入片段本身就是OE-PCR产物，因有非特异扩增 进行了凝胶回收；
然后载体和片段分别限制性酶切；
载体进行纯化（酚氯仿抽提）后用于连接，
片段通常需要进行凝胶回收后用于连接，
但我这种情况，还需要再次凝胶回收吗？还是可以和载体一起进行纯化？
请有经验的大侠指导！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
原来你也在这里
1楼 2015-06-16 23:35:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
惰惰228: 金币+1 2015-06-18 01:13:15
酶切后需要做切胶回收纯化，连接片段的纯度会影响连接效率。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2015-06-17 10:47:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惰惰228

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-06-17 10:47:14
酶切后需要做切胶回收纯化，连接片段的纯度会影响连接效率。

可以做用pcr产物纯化试剂盒进行纯化么？还有必要再电泳、切胶回收吗？
赞一下 回复此楼
原来你也在这里
3楼2015-06-18 00:47:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
惰惰228: 金币+1 2015-06-23 22:38:42
引用回帖:
3楼: Originally posted by 惰惰228 at 2015-06-18 00:47:43
可以做用pcr产物纯化试剂盒进行纯化么？还有必要再电泳、切胶回收吗？...

我上次理解有误。可以用PCR产物纯化试剂盒纯化。切掉的两头的保护碱基一般洗脱时就被洗掉了。
赞一下 回复此楼
4楼2015-06-18 12:19:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2015-06-18 12:19:03
我上次理解有误。可以用PCR产物纯化试剂盒纯化。切掉的两头的保护碱基一般洗脱时就被洗掉了。...

我上次理解有误。可以用PCR产物纯化试剂盒纯化。切掉的两头的保护碱基一般漂洗时就被洗掉了。
赞一下 回复此楼
5楼2015-06-18 12:20:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangjingjing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
惰惰228: 金币+1 2015-06-23 22:39:05
酶切完回收一次就够了，没必要那么多次吧
赞一下 回复此楼
努力打败一切
6楼2015-06-19 10:56:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
惰惰228(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:49:17
PCR产物胶回收之后酶切，然后再跑胶回收，最后产物浓度会非常低的，严重影响连接，而且内切酶切割DNA也是需要锚定位点的，所以PCR产物直接酶切本身效率就很低，加上如此折腾，最后连接会有麻烦，建议如下做，虽然麻烦，但是会一帆风顺的：将PCR产物连T载体，选测序正确的菌株抽提质粒再双酶切，酶切片段在电泳时很明显，再胶回收做连接。
赞一下 回复此楼
没有做不到，只有想不到！
7楼2015-06-19 20:46:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惰惰228

银虫 (小有名气)
T载体实验室都不用，没有经验。
或者pcr产物 先纯化 再酶切 再回收呢？只回收一次。两端加了保护碱基了倒是。
我的pcr产物杂带多，有点烦。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
原来你也在这里
8楼2015-06-21 09:15:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惰惰228

银虫 (小有名气)
这样问吧，在pcr产物有杂带的前提下，是 胶回收—酶切—纯化，还是 纯化—酶切—胶回收？谢谢各位！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
原来你也在这里
9楼2015-06-21 09:18:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ttgacataat

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
惰惰228: 金币+1, ★有帮助 2015-06-21 22:16:03
惰惰228: 金币+1 2015-06-23 22:39:46
PCR产物有杂带，而且直接酶切PCR产物，得到的可能性很低，建议重新PCR，摸索条件，回收PCR产物后连T载体，酶切……

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
10楼2015-06-21 10:34:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 惰惰228 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 333求调剂 +6 wfh030413@ 2026-03-23 6/300 2026-03-26 22:45 by 学员8dgXkO
[考研] 329求调剂 +5 1() 2026-03-22 5/250 2026-03-26 20:40 by fmesaito
[考研] 求调剂 +8 Auroracx 2026-03-22 8/400 2026-03-26 19:55 by 不吃魚的貓
[考研] 材料调剂 +7 匹克i 2026-03-23 7/350 2026-03-26 19:00 by 不吃魚的貓
[考研] 085602化学工程求调剂。 +4 平乐乐乐 2026-03-26 4/200 2026-03-26 17:57 by fmesaito
[考研] 275求调剂 +9 Micky11223 2026-03-25 11/550 2026-03-26 15:54 by 不吃魚的貓
[考研] 279 分 求调剂 +3 睡个好觉_16 2026-03-24 3/150 2026-03-26 15:43 by zzll406
[硕博家园] 北京林业大学硕导招生广告 +5 kongweilin 2026-03-26 7/350 2026-03-26 14:37 by mapenggao
[材料工程] 一志愿C9材料与化工专业总分300求调剂 +5 曼111 2026-03-24 6/300 2026-03-26 13:04 by 13756423260
[考研] 299求调剂 +7 某某某某位 2026-03-21 8/400 2026-03-25 20:34 by 热情沙漠
[考研] 359求调剂 +3 王了个楠 2026-03-25 3/150 2026-03-25 12:50 by Dyhoer
[考研] 0854电子信息求调剂 324 +4 Promise-jyl 2026-03-23 4/200 2026-03-25 11:36 by Sugarlight
[考研] 求调剂323材料与化工 +4 1124361 2026-03-24 4/200 2026-03-25 11:19 by shulmg
[考研] 材料学硕，求调剂 6+4 糖葫芦888ll 2026-03-22 9/450 2026-03-25 11:19 by greychen00
[考研] 考研化学308分求调剂 +10 你好明天你好 2026-03-23 11/550 2026-03-25 10:23 by userper
[考研] 生物学学硕求调剂 +7 小羊睡着了? 2026-03-23 10/500 2026-03-25 02:24 by 清风拂扬。 m
[考研] 化工专硕求调剂 +3 question挽风 2026-03-24 3/150 2026-03-24 18:48 by jhhcooi
[考研] 一志愿河北工业大学0817化工278分求调剂 +7 jhybd 2026-03-23 12/600 2026-03-24 09:03 by jhybd
[考研] 一志愿东华大学化学070300，求调剂 +7 2117205181 2026-03-21 8/400 2026-03-22 22:55 by chixmc
[考研] 求助 +5 梦里的无言 2026-03-21 6/300 2026-03-21 17:51 by 学员8dgXkO
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭