应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建载体 待插入片段本身就是pcr凝胶回收产物 酶切后还需要再凝胶回收用于连接吗
101/1返回列表
查看: 4807  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

惰惰228

银虫 (小有名气)

[求助] 构建载体 待插入片段本身就是pcr凝胶回收产物 酶切后还需要再凝胶回收用于连接吗 已有4人参与

打算构建一个载体，待插入片段本身就是OE-PCR产物，因有非特异扩增 进行了凝胶回收；
然后载体和片段分别限制性酶切；
载体进行纯化（酚氯仿抽提）后用于连接，
片段通常需要进行凝胶回收后用于连接，
但我这种情况，还需要再次凝胶回收吗？还是可以和载体一起进行纯化？
请有经验的大侠指导！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
原来你也在这里
1楼 2015-06-16 23:35:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
惰惰228: 金币+1 2015-06-18 01:13:15
酶切后需要做切胶回收纯化，连接片段的纯度会影响连接效率。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2015-06-17 10:47:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惰惰228

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-06-17 10:47:14
酶切后需要做切胶回收纯化，连接片段的纯度会影响连接效率。

可以做用pcr产物纯化试剂盒进行纯化么？还有必要再电泳、切胶回收吗？
赞一下 回复此楼
原来你也在这里
3楼2015-06-18 00:47:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
惰惰228: 金币+1 2015-06-23 22:38:42
引用回帖:
3楼: Originally posted by 惰惰228 at 2015-06-18 00:47:43
可以做用pcr产物纯化试剂盒进行纯化么？还有必要再电泳、切胶回收吗？...

我上次理解有误。可以用PCR产物纯化试剂盒纯化。切掉的两头的保护碱基一般洗脱时就被洗掉了。
赞一下 回复此楼
4楼2015-06-18 12:19:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2015-06-18 12:19:03
我上次理解有误。可以用PCR产物纯化试剂盒纯化。切掉的两头的保护碱基一般洗脱时就被洗掉了。...

我上次理解有误。可以用PCR产物纯化试剂盒纯化。切掉的两头的保护碱基一般漂洗时就被洗掉了。
赞一下 回复此楼
5楼2015-06-18 12:20:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangjingjing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
惰惰228: 金币+1 2015-06-23 22:39:05
酶切完回收一次就够了，没必要那么多次吧
赞一下 回复此楼
努力打败一切
6楼2015-06-19 10:56:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
惰惰228(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:49:17
PCR产物胶回收之后酶切，然后再跑胶回收，最后产物浓度会非常低的，严重影响连接，而且内切酶切割DNA也是需要锚定位点的，所以PCR产物直接酶切本身效率就很低，加上如此折腾，最后连接会有麻烦，建议如下做，虽然麻烦，但是会一帆风顺的：将PCR产物连T载体，选测序正确的菌株抽提质粒再双酶切，酶切片段在电泳时很明显，再胶回收做连接。
赞一下 回复此楼
没有做不到，只有想不到！
7楼2015-06-19 20:46:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惰惰228

银虫 (小有名气)
T载体实验室都不用，没有经验。
或者pcr产物 先纯化 再酶切 再回收呢？只回收一次。两端加了保护碱基了倒是。
我的pcr产物杂带多，有点烦。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
原来你也在这里
8楼2015-06-21 09:15:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惰惰228

银虫 (小有名气)
这样问吧，在pcr产物有杂带的前提下，是 胶回收—酶切—纯化，还是 纯化—酶切—胶回收？谢谢各位！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
原来你也在这里
9楼2015-06-21 09:18:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ttgacataat

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
惰惰228: 金币+1, ★有帮助 2015-06-21 22:16:03
惰惰228: 金币+1 2015-06-23 22:39:46
PCR产物有杂带，而且直接酶切PCR产物，得到的可能性很低，建议重新PCR，摸索条件，回收PCR产物后连T载体，酶切……

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
10楼2015-06-21 10:34:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 惰惰228 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 能否申诉？ +4 echo8914667 2026-08-30 4/200 2026-08-30 16:03 by sundiv
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 7/350 2026-08-30 12:13 by l0VvVHGBGRLv
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-30 11:41 by l0VvVHGBGRLv
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-30 11:19 by l0VvVHGBGRLv
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 4/200 2026-08-30 07:39 by ZPa0EcMwuECS
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 4/200 2026-08-30 07:28 by ZPa0EcMwuECS
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 06:57 by ZPa0EcMwuECS
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 10/500 2026-08-30 06:11 by ZPa0EcMwuECS
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 5/250 2026-08-30 02:40 by ZPa0EcMwuECS
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 02:09 by ZPa0EcMwuECS
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 01:58 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭