24小时热门版块排行榜    

查看: 4800  |  回复: 9

惰惰228

银虫 (小有名气)

[求助] 构建载体 待插入片段本身就是pcr凝胶回收产物 酶切后还需要再凝胶回收用于连接吗 已有4人参与

打算构建一个载体,待插入片段本身就是OE-PCR产物,因有非特异扩增 进行了凝胶回收;
然后载体和片段分别限制性酶切;
载体进行纯化(酚氯仿抽提)后用于连接,
片段通常需要进行凝胶回收后用于连接,
但我这种情况,还需要再次凝胶回收吗?还是可以和载体一起进行纯化?
请有经验的大侠指导!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

原来你也在这里
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
惰惰228: 金币+1 2015-06-18 01:13:15
酶切后需要做切胶回收纯化,连接片段的纯度会影响连接效率。
2楼2015-06-17 10:47:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惰惰228

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-06-17 10:47:14
酶切后需要做切胶回收纯化,连接片段的纯度会影响连接效率。

可以做用pcr产物纯化试剂盒进行纯化么?还有必要再电泳、切胶回收吗?
原来你也在这里
3楼2015-06-18 00:47:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


惰惰228: 金币+1 2015-06-23 22:38:42
引用回帖:
3楼: Originally posted by 惰惰228 at 2015-06-18 00:47:43
可以做用pcr产物纯化试剂盒进行纯化么?还有必要再电泳、切胶回收吗?...

我上次理解有误。可以用PCR产物纯化试剂盒纯化。切掉的两头的保护碱基一般洗脱时就被洗掉了。
4楼2015-06-18 12:19:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2015-06-18 12:19:03
我上次理解有误。可以用PCR产物纯化试剂盒纯化。切掉的两头的保护碱基一般洗脱时就被洗掉了。...

我上次理解有误。可以用PCR产物纯化试剂盒纯化。切掉的两头的保护碱基一般漂洗时就被洗掉了。
5楼2015-06-18 12:20:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangjingjing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
惰惰228: 金币+1 2015-06-23 22:39:05
酶切完回收一次就够了,没必要那么多次吧
努力打败一切
6楼2015-06-19 10:56:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
惰惰228(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:49:17
PCR产物胶回收之后酶切,然后再跑胶回收,最后产物浓度会非常低的,严重影响连接,而且内切酶切割DNA也是需要锚定位点的,所以PCR产物直接酶切本身效率就很低,加上如此折腾,最后连接会有麻烦,建议如下做,虽然麻烦,但是会一帆风顺的:将PCR产物连T载体,选测序正确的菌株抽提质粒再双酶切,酶切片段在电泳时很明显,再胶回收做连接。
没有做不到,只有想不到!
7楼2015-06-19 20:46:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惰惰228

银虫 (小有名气)

T载体实验室都不用,没有经验。
或者pcr产物 先纯化 再酶切 再回收呢?只回收一次。两端加了保护碱基了倒是。
我的pcr产物杂带多,有点烦。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
原来你也在这里
8楼2015-06-21 09:15:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惰惰228

银虫 (小有名气)

这样问吧,在pcr产物有杂带的前提下,是 胶回收—酶切—纯化,还是 纯化—酶切—胶回收?谢谢各位!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
原来你也在这里
9楼2015-06-21 09:18:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ttgacataat

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
惰惰228: 金币+1, 有帮助 2015-06-21 22:16:03
惰惰228: 金币+1 2015-06-23 22:39:46
PCR产物有杂带,而且直接酶切PCR产物,得到的可能性很低,建议重新PCR,摸索条件,回收PCR产物后连T载体,酶切……

[ 发自小木虫客户端 ]
10楼2015-06-21 10:34:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 惰惰228 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +13 晴天加油 2026-08-26 14/700 2026-08-28 18:36 by huagongfeihu
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[教师之家] 导师吐槽:我怎么摊上了这么个极品研究生! +8 苏东坡二世 2026-08-23 8/400 2026-08-28 14:41 by lkforward
[基金申请] 基金不中,共勉 +11 eulota 2026-08-26 11/550 2026-08-28 14:22 by 火星超人xi
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了,把查询到的截图贴出来让我看看,让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +7 process2012 2026-08-23 10/500 2026-08-26 19:23 by hmhminy
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件,有关系吗? +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 牛来!米来!面来! +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 明天应该可查了!? +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑,不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办? +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
信息提示
请填处理意见