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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建载体 待插入片段本身就是pcr凝胶回收产物 酶切后还需要再凝胶回收用于连接吗
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惰惰228

银虫 (小有名气)

[求助] 构建载体 待插入片段本身就是pcr凝胶回收产物 酶切后还需要再凝胶回收用于连接吗已有4人参与

打算构建一个载体，待插入片段本身就是OE-PCR产物，因有非特异扩增 进行了凝胶回收；
然后载体和片段分别限制性酶切；
载体进行纯化（酚氯仿抽提）后用于连接，
片段通常需要进行凝胶回收后用于连接，
但我这种情况，还需要再次凝胶回收吗？还是可以和载体一起进行纯化？
请有经验的大侠指导！
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1楼2015-06-16 23:35:05
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
惰惰228: 金币+1 2015-06-18 01:13:15
酶切后需要做切胶回收纯化，连接片段的纯度会影响连接效率。
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2楼2015-06-17 10:47:14
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惰惰228

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-06-17 10:47:14
酶切后需要做切胶回收纯化，连接片段的纯度会影响连接效率。

可以做用pcr产物纯化试剂盒进行纯化么？还有必要再电泳、切胶回收吗？
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3楼2015-06-18 00:47:43
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
惰惰228: 金币+1 2015-06-23 22:38:42
引用回帖:
3楼: Originally posted by 惰惰228 at 2015-06-18 00:47:43
可以做用pcr产物纯化试剂盒进行纯化么？还有必要再电泳、切胶回收吗？...

我上次理解有误。可以用PCR产物纯化试剂盒纯化。切掉的两头的保护碱基一般洗脱时就被洗掉了。
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4楼2015-06-18 12:19:03
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2015-06-18 12:19:03
我上次理解有误。可以用PCR产物纯化试剂盒纯化。切掉的两头的保护碱基一般洗脱时就被洗掉了。...

我上次理解有误。可以用PCR产物纯化试剂盒纯化。切掉的两头的保护碱基一般漂洗时就被洗掉了。
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5楼2015-06-18 12:20:08
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
惰惰228: 金币+1 2015-06-23 22:39:05
酶切完回收一次就够了，没必要那么多次吧
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努力打败一切
6楼2015-06-19 10:56:57
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
惰惰228(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:49:17
PCR产物胶回收之后酶切，然后再跑胶回收，最后产物浓度会非常低的，严重影响连接，而且内切酶切割DNA也是需要锚定位点的，所以PCR产物直接酶切本身效率就很低，加上如此折腾，最后连接会有麻烦，建议如下做，虽然麻烦，但是会一帆风顺的：将PCR产物连T载体，选测序正确的菌株抽提质粒再双酶切，酶切片段在电泳时很明显，再胶回收做连接。
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没有做不到，只有想不到！
7楼2015-06-19 20:46:20
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惰惰228

银虫 (小有名气)
T载体实验室都不用，没有经验。
或者pcr产物 先纯化 再酶切 再回收呢？只回收一次。两端加了保护碱基了倒是。
我的pcr产物杂带多，有点烦。

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8楼2015-06-21 09:15:31
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惰惰228

银虫 (小有名气)
这样问吧，在pcr产物有杂带的前提下，是 胶回收—酶切—纯化，还是 纯化—酶切—胶回收？谢谢各位！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2015-06-21 09:18:20
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ttgacataat

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
惰惰228: 金币+1, ★有帮助 2015-06-21 22:16:03
惰惰228: 金币+1 2015-06-23 22:39:46
PCR产物有杂带，而且直接酶切PCR产物，得到的可能性很低，建议重新PCR，摸索条件，回收PCR产物后连T载体，酶切……

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2015-06-21 10:34:24
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