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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切问题，急~
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lilylil

铁虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切问题，急~ 已有18人参与

本人现在用Not I 和EcoR I 双酶切，目的片段60bp,载体是PUC57总是显示一条带，用酶各自单切都可切开，用的是Takara的酶。
反应体系1μl Not I
              1μl EcoR I
              4μl 0.1% BSA
              4μl 10×H
              25μl 质粒（≤1μg）
              5μl    水
37℃，3h
现在实验就卡在这了，很急请大家多多指导
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1楼 2015-05-04 16:27:42
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-04 23:20:02
可以尝试一下高浓度的胶，不过中间片段只有60bp的话很难看出来……可以用没有切过的载体做对照。祝顺利！
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
3楼2015-05-04 16:53:05
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普通回帖

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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我切过80BP的，跑电泳看不出来，但质粒确实切开了，后来也连上了。
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采菊东篱下，悠然见南山。
2楼2015-05-04 16:41:56
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沉默的独角兽

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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会不会是两个酶切位点靠得太近？
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4楼2015-05-04 18:04:15
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匿名

荣誉版主 (知名作家)

优秀版主
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5楼2015-05-04 18:11:40
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cckk_2000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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lilylil(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-06 19:29:50
你的载体一般都是上万bp，切掉60bp的话，它本身分子量没有太大影响，而且60根本在电泳中看不见，原因是结合的荧光染料太少了。你可以连接、转化挑克隆去测序。
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科研炮灰
6楼2015-05-05 10:42:14
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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60bp的 片段短，胶上容易跑出去，，还有一点，60bp片段占质粒分子才多少？估计就几十分之一，大片段的几十分之一的浓度，你觉得会有多明显？
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7楼2015-05-05 11:01:43
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632362481

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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60bp片段太小了，建议做胶的时候密度大点。
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。。。
8楼2015-05-05 11:41:14
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jingyu501

禁虫 (正式写手)
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9楼2015-05-05 12:31:37
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zhang6871

银虫 (正式写手)
一般情况下60bp很难观测到的。
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过于功利，浮躁，布满灰尘的心都是创新的杀手!多记，心静，多动手，贴近大自然!
10楼2015-05-06 11:19:45
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