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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR无阳性条带求助！
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lxyyzz

木虫 (小有名气)

[求助] 菌液PCR无阳性条带求助！ 已有4人参与

RT，分子克隆鉴定的时候进行菌液PCR，无阳性条带，后来阳性对照实验如下：
1. 用原始质粒DNA做模板进行PCR，有条带
2. 用原始质粒的甘油菌做模板进行PCR，无条带！
说明整个菌液PCR过程有问题，包含原始质粒的菌液都无法出现阳性条带。
求助各位可能是哪方面的问题？
（菌液PCR使用2X Taq mix，
使用程序第一步为热变性，95度10分钟和20分钟两个条件我都试过，但原始质粒的菌液PCR都没有条带）
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1楼 2015-03-30 19:48:45
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天——下

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lxyyzz: 金币+3, ★有帮助, 1. 我的引物大概40bp左右，菌落PCR不能用长引物是什么原理呢？与质粒PCR有什么不同呢 2. 本来设计的煮样10min是让细菌裂解，使得DNA释放出来作为模板 3. MIX使用的时候是稀释为1X的才用的 2015-03-31 20:43:19
lxyyzz: 金币+1, ★★★★★最佳答案, 确实是引物的问题。我换了一个短一些的就P出来了，看来是菌液模板太复杂，引物特异性不行的结果。非常感谢！ 2015-04-01 14:16:47
你的引物长度多少？菌落pcr不能用长引物的；另外taq的话预变性5min足矣；mix用1*吧，干嘛用2*的呢？
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8楼2015-03-31 17:14:26
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lxzk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lxyyzz: 金币+2, ★有帮助, 我感觉是菌液的DNA没有释放出来，因为用质粒DNA做模板是可以做出条带的啊 2015-03-31 09:37:08
第一，菌用量多了或者少了都会p不出来，第二，其实不用热变性10分钟，我一般做5分钟，不过最好用热启动酶，第三，换更高效的酶，如果可以的话我建议用kapa的2g robust hotstart mix，1k以下的片段从来没有失败过

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-03-31 08:53:53
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lxyyzz: 金币+3, ★★★很有帮助, 1. 是普通的Taq聚合酶 2. 除了模板不同之外条件一摸一样，是预混后分装的 3. 无条带的意思是目标条带、杂带都没有 2015-03-31 09:39:24
2乘Taq mix 是普通的Taq DNA聚合酶吧？？预变性尽然用95℃10-20min？一般的酶变性没有这么长时间啊，一般只有用化学修饰或者抗体修饰的的热启动聚合酶才需要10min吧，你这有条带和无条带，除了模板不同之外其他反应试剂条件都是一样的吗？无条带是没有目的条带出来那有没有杂带呢，也没说啊
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-03-31 09:02:37
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lxyyzz: 金币+1, ★有帮助 2015-03-31 09:39:47
我一般先把菌液摇3个小时，在离心，拿10ul的枪头沾一下沉淀（只要沾一下就行)，在跑PCR，结果都很好。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2015-03-31 09:23:01
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