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lxyyzz木虫 (小有名气)
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[求助]
菌液PCR无阳性条带求助！已有4人参与
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RT，分子克隆鉴定的时候进行菌液PCR，无阳性条带，后来阳性对照实验如下： 1. 用原始质粒DNA做模板进行PCR，有条带 2. 用原始质粒的甘油菌做模板进行PCR，无条带！ 说明整个菌液PCR过程有问题，包含原始质粒的菌液都无法出现阳性条带。 求助各位可能是哪方面的问题？ （菌液PCR使用2X Taq mix， 使用程序第一步为热变性，95度10分钟和20分钟两个条件我都试过，但原始质粒的菌液PCR都没有条带） |
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lxyyzz: 金币+3, ★有帮助, 1. 我的引物大概40bp左右，菌落PCR不能用长引物是什么原理呢？与质粒PCR有什么不同呢 2. 本来设计的煮样10min是让细菌裂解，使得DNA释放出来作为模板 3. MIX使用的时候是稀释为1X的才用的 2015-03-31 20:43:19
lxyyzz: 金币+1, ★★★★★最佳答案, 确实是引物的问题。我换了一个短一些的就P出来了，看来是菌液模板太复杂，引物特异性不行的结果。非常感谢！ 2015-04-01 14:16:47
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lxyyzz: 金币+3, ★有帮助, 1. 我的引物大概40bp左右，菌落PCR不能用长引物是什么原理呢？与质粒PCR有什么不同呢 2. 本来设计的煮样10min是让细菌裂解，使得DNA释放出来作为模板 3. MIX使用的时候是稀释为1X的才用的 2015-03-31 20:43:19
lxyyzz: 金币+1, ★★★★★最佳答案, 确实是引物的问题。我换了一个短一些的就P出来了，看来是菌液模板太复杂，引物特异性不行的结果。非常感谢！ 2015-04-01 14:16:47
| 你的引物长度多少？菌落pcr不能用长引物的；另外taq的话预变性5min足矣；mix用1*吧，干嘛用2*的呢？ |
8楼2015-03-31 17:14:26
2楼2015-03-31 08:53:53
18761615793
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
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lxyyzz: 金币+3, ★★★很有帮助, 1. 是普通的Taq聚合酶 2. 除了模板不同之外条件一摸一样，是预混后分装的 3. 无条带的意思是目标条带、杂带都没有 2015-03-31 09:39:24
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lxyyzz: 金币+3, ★★★很有帮助, 1. 是普通的Taq聚合酶 2. 除了模板不同之外条件一摸一样，是预混后分装的 3. 无条带的意思是目标条带、杂带都没有 2015-03-31 09:39:24
| 2乘Taq mix 是普通的Taq DNA聚合酶吧？？预变性尽然用95℃10-20min？一般的酶变性没有这么长时间啊，一般只有用化学修饰或者抗体修饰的的热启动聚合酶才需要10min吧，你这有条带和无条带，除了模板不同之外其他反应试剂条件都是一样的吗？无条带是没有目的条带出来那有没有杂带呢，也没说啊 |
3楼2015-03-31 09:02:37
781055707
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4楼2015-03-31 09:23:01