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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒 双酶切鉴定 条带大小问题
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永峰1230

铜虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒 双酶切鉴定 条带大小问题 已有1人参与

连接转化后 提取质粒， 双酶切鉴定， 如图所示：10000marker， 质粒，hind III 单酶切、XhoI 单酶切、 Hind III 和XhoI 双酶切。       双酶切之后在1000 bp处应该有目的基因的条带
  1000 marker （10000、7000、4000、2000、1000、500、250），  条带 酶切的比 质粒还要大！！！ 双酶切和 XhoI 单酶切 好像没有区别，这是咋么会事呢？

重组质粒 双酶切鉴定 条带大小问题
酶切鉴定.jpg
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12
1楼 2015-01-14 17:29:52
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ptttmt

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
永峰1230: 金币+6, ★★★很有帮助 2015-01-15 10:56:59
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-15 18:19:03
永峰1230: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2015-01-22 08:23:16
从图看，是试剂盒提的质粒，质量非常高，基本上都是超螺旋的。超螺旋的质粒是跑的最快的，所以单酶切的质粒比超螺旋质粒跑的慢是正确的。但是Hind III单切泳道和超螺旋质粒泳道相似，貌似Hind III单切泳道质粒的量更大些，提示可能Hind III没有切动。双酶切和Xho I单切，大片段理论相差1000bp，但这种差异在胶上是很难看出来的，由于双酶切没有切出1000的条带，提示Xho I切开了Hind III没切开。
综合起来，Hind III酶没切动，可能是这个酶出问题了。建议换一支Hind III酶，再仔细检查下酶切缓冲液是否用对，同时注意双酶切的2个酶是否能共用buffer的问题。
另外，你酶切体系加的质粒太多了，建议适当减少。

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-01-15 06:55:24
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永峰1230

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ptttmt at 2015-01-15 06:55:24
从图看，是试剂盒提的质粒，质量非常高，基本上都是超螺旋的。超螺旋的质粒是跑的最快的，所以单酶切的质粒比超螺旋质粒跑的慢是正确的。但是Hind III单切泳道和超螺旋质粒泳道相似，貌似Hind III单切泳道质粒的量更 ...

谢谢你，，我再试一试， Hind III 是新买的，应该没问题，  这两个在http://www.thermoscientificbio.c ... st/?ca=doubledigest   网站上查过是可以 公用buffer的 ，  可能是你说的 质粒太多了 ，酶切动，，我再做一次
赞一下 回复此楼
12
3楼2015-01-15 10:58:42
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ptttmt

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 永峰1230 at 2015-01-15 10:58:42
谢谢你，，我再试一试， Hind III 是新买的，应该没问题，  这两个在http://www.thermoscientificbio.com/webtools/doubledigest/?ca=doubledigest   网站上查过是可以 公用buffer的 ，  可能是你说的 质粒太多了  ...

找到原因了？？？是啥问题啊？
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4楼2015-01-22 10:05:20
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