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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 片段克隆问题
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wwjinx

新虫 (小有名气)

[求助] 片段克隆问题 已有2人参与

各位大神，这一两个月我做连接DNA片段到T载体里送出去测序，测序公司总是活化培养不出我送的菌液，我的片段大小分别为200-800之间，T载体为PMA19-T，感受态为Top10，IPTG和X-gal均没问题。送出菌液之前，摇培时间4,、6、8、10、12和16小时都试过，菌液里分别加30%甘油和不加甘油也都试过了。这是什么原因？？？
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1楼 2015-01-13 13:23:40
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korchagin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该做一次复筛，去掉假阳性
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3楼2015-01-13 16:12:45
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wwjinx(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:13:47
送菌液之前，先用通用引物或者你自己的特异引物做一次菌液PCR，最好是用通用引物上游+特异引物下游做一次菌液PCR，验证阳性克隆，再送出去测序。如果担心测序公司摇不好，你也可以自己把质粒提出来，送质粒去测序。当然，你也可以送PCR产物去测序（确认条带单一）或是自己切胶，送纯化后的PCR产物测序。
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2楼2015-01-13 14:07:38
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wwjinx

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by korchagin at 2015-01-13 16:12:45
应该做一次复筛，去掉假阳性

应该不存在假阳性的  挑菌摇培前都经菌落PCR验证过
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4楼2015-01-13 18:11:21
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wwjinx

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-13 14:07:38
送菌液之前，先用通用引物或者你自己的特异引物做一次菌液PCR，最好是用通用引物上游+特异引物下游做一次菌液PCR，验证阳性克隆，再送出去测序。如果担心测序公司摇不好，你也可以自己把质粒提出来，送质粒去测序。 ...

这些问题我都考虑过，我只是不明白为什么我送出去的菌到测序公司后总是出现活化不出来的情况
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5楼2015-01-13 20:58:43
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