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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于克隆中出现卫星菌落的问题，求指教
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gundamba

木虫 (小有名气)

[求助] 关于克隆中出现卫星菌落的问题，求指教

最近做克隆，构建质粒，转化大肠，氨苄筛克隆，但是板子上的单克隆总是出现卫星菌落，PCR也没有阳性克隆，请问这是为什么呢？
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1楼 2012-05-31 08:57:07
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poog502

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-31 09:45:15
1、提高氨苄浓度。
2、换载体，比如promega的pGEM-T Easy载体，几乎未曾失手，缺点是太贵和酶切位点太少。
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2楼2012-05-31 09:01:52
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gundamba

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by poog502 at 2012-05-31 09:01:52
1、提高氨苄浓度。
2、换载体，比如promega的pGEM-T Easy载体，几乎未曾失手，缺点是太贵和酶切位点太少。

1.氨苄浓度肯定没有问题，一块倒的板子，其它人做没有出现这个问题。
2.第二个方法是换载体，是迫不得已的方法了，现在也在做，但是目前不太清楚问什么会发生这个问题
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3楼2012-05-31 09:47:20
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lansehaitun

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
估计是外源片段没连上，载体自身又自连了，建议每一步都进行切胶回收，或者更换酶切位点
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4楼2012-05-31 10:10:10
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动力泉

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
出现卫星菌落是因为培养时间太长所致，建议缩短培养时间。对于没有阳性克隆建议酶切验证试试，也可能是T载体有问题，可以做对照试试
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好好学习
5楼2012-05-31 10:15:54
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microblue

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用氨苄的时候要特别注意不能培养太久，因为β-内酰胺酶会把抗性菌落周围的氨苄降解掉，产生卫星菌落。
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6楼2012-05-31 11:38:45
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liyamei123

银虫 (小有名气)
换感受态看看
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言之无文行而不远
7楼2012-06-01 09:46:12
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yipianye69

金虫 (著名写手)
可以考虑换下感受态！
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8楼2012-06-27 14:54:48
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moqiyilei

金虫 (小有名气)
看一下回收片段纯度怎么样，随便一个片段只要有A尾的都可以与T载体相连，就都会导致假阳性，所以菌P就没有。
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9楼2012-06-27 15:10:05
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