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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)

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[求助] BAC克隆相关问题请教

1. 找别的课题组拿了一个BAC的质粒DNA，氯霉素抗性，外源片段180kb左右。想转到大肠杆菌中扩繁，但是36小时才有克隆，菌落和质粒PCR均为阴性，一般这种情况正常长出克隆需要多长时间？如何提高转化效率？
Ps：感受态细胞是商业化的，热激转化和电转化的都试过。

2. 如果在此BAC基础上想酶切后回收30-50kb左右的片段，如果没有脉冲电泳仪，有什么好的方法可以完成。有人建议蔗糖梯度离心，但是没有找到相应的纯化特定大小DNA的方法，纯化蛋白质的倒是有很多。有哪位赐教相应的详细步骤？

不甚感激！

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1楼 2013-01-15 18:20:14

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dshlove

木虫 (正式写手)

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★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dfl204: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢，如你所说，还有一些细节需要再多注意一点。 2013-01-16 12:18:35

个人建议
大肠杆菌一般过夜就能长出克隆，如果你的感受态没有问题的话。
转化效率的影响最大的两个因素就是质粒浓度和感受态。商业化感受态批次不同有时候转化差很多，这得注意。
还有就是质粒的纯度和转化加入的量的问题了，一般1ng的DNA就能饱和50ul的感受态的。
至于大质粒酶切回收小片段，我没成功过。不能瞎说。
能帮到就这么多了……

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2楼2013-01-16 10:58:51

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dshlove

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★
dfl204: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2013-01-17 07:49:03

引用回帖:

2楼: Originally posted by dshlove at 2013-01-16 10:58:51
个人建议
大肠杆菌一般过夜就能长出克隆，如果你的感受态没有问题的话。
转化效率的影响最大的两个因素就是质粒浓度和感受态。商业化感受态批次不同有时候转化差很多，这得注意。
还有就是质粒的纯度和转化加入的 ...

嗯，其实有时候各方面都注意了，就是出不来东西，慢慢来，希望实验顺利啊。