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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 定点突变，转化后没有长出克隆
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慕容清婉

木虫 (小有名气)

[求助] 定点突变，转化后没有长出克隆 已有4人参与

各位前辈，最近在做定点突变，单个点突变，一共做了4个(544,719,721,724位)，酶是takara的primestar，质粒全长是9K，PCR（退火温度是55℃）后进行DpnI酶切，转化至DH5α，第二天只有724位突变的长出了单克隆。另外三个没有长出单克隆，我分析是PCR步骤有问题，就把退火温度降到了53℃，这次转化后仍然没有单克隆长出。
新手第一次进行定点突变，现在不知道接下来该从哪方面入手？望各位前辈不吝赐教，感激不尽！
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1楼 2014-10-16 10:06:31
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-10-16 11:14:54
突变PCR产物跑个琼脂糖胶，看看有没有扩增出来，如果扩增出来了，有可能是你的转化或者感受态细胞出问题了。建议做转化的时候做个PUC19质粒的转化对照，确保感受态细胞没有问题。
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rainwater
2楼2014-10-16 10:12:21
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慕容清婉

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-10-16 10:12:21
突变PCR产物跑个琼脂糖胶，看看有没有扩增出来，如果扩增出来了，有可能是你的转化或者感受态细胞出问题了。建议做转化的时候做个PUC19质粒的转化对照，确保感受态细胞没有问题。

感受态应该是没问题，之前一直用来做转化，这次做的四个突变，有一个成功了，但是另外三个没长出克隆。怀疑是没p出来
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3楼2014-10-16 10:21:44
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wshi85

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
慕容清婉(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-01 19:23:12
这个很可能是你设计的引物不好！建议你重新设计引物做点突变，最好是重新设计引物pcr出来在构建到载体上，这种效率也是不错的
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很久没在虫虫上漂游了，觉得回归虫虫！
4楼2014-10-16 22:50:24
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR后先取样跑胶检测下，阳性再酶切，转化。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2014-10-16 23:39:50
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慕容清婉

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wshi85 at 2014-10-16 22:50:24
这个很可能是你设计的引物不好！建议你重新设计引物做点突变，最好是重新设计引物pcr出来在构建到载体上，这种效率也是不错的

嗯，我再试试
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6楼2014-11-01 16:38:51
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
慕容清婉(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-01 19:23:32
quickchange 有些质粒很好做，有些质粒不好做。建议用overlap pcr 进行突变后，酶切连接，这样对于不好做的质粒效率更高。

[ 发自小木虫客户端 ]
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7楼2014-11-01 16:43:59
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