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慕容清婉

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[求助] 定点突变，转化后没有长出克隆已有4人参与

各位前辈，最近在做定点突变，单个点突变，一共做了4个(544,719,721,724位)，酶是takara的primestar，质粒全长是9K，PCR（退火温度是55℃）后进行DpnI酶切，转化至DH5α，第二天只有724位突变的长出了单克隆。另外三个没有长出单克隆，我分析是PCR步骤有问题，就把退火温度降到了53℃，这次转化后仍然没有单克隆长出。
新手第一次进行定点突变，现在不知道接下来该从哪方面入手？望各位前辈不吝赐教，感激不尽！

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1楼 2014-10-16 10:06:31

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zhangyunjing

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【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-10-16 11:14:54

突变PCR产物跑个琼脂糖胶，看看有没有扩增出来，如果扩增出来了，有可能是你的转化或者感受态细胞出问题了。建议做转化的时候做个PUC19质粒的转化对照，确保感受态细胞没有问题。

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rainwater

2楼2014-10-16 10:12:21

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慕容清婉

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2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-10-16 10:12:21
突变PCR产物跑个琼脂糖胶，看看有没有扩增出来，如果扩增出来了，有可能是你的转化或者感受态细胞出问题了。建议做转化的时候做个PUC19质粒的转化对照，确保感受态细胞没有问题。

感受态应该是没问题，之前一直用来做转化，这次做的四个突变，有一个成功了，但是另外三个没长出克隆。怀疑是没p出来

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3楼2014-10-16 10:21:44

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