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review银虫 (著名写手)
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[求助]
求助 分子克隆转化技术流程
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1.引物设计获得扩增片段 2.回收片段 3.回收片段加A 4.载体酶切 5.加A后片段和酶切后的载体进行连接 6.连接产物转化大肠杆菌 7.单克隆菌株检测 8.测序。测序是把阳性克隆的菌，摇菌后所得的菌拿去测序吗？测序是怎么验证呢？ 9.测序确认了，接着提菌液里的质粒。 10. 转化。这里不懂了！有什么摇菌 酶切 鉴定...... 求高人指点！ |
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zhangby2002
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【答案】应助回帖
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摇菌是指为了在平板培养基上培养菌落以便提取克隆（防止假阳性）， 酶切鉴定是指的你的质粒是否连接到载体上，没连接上说明失败。具体测序你可以用菌液，有的为了省钱用PCR产物，这些你可以参阅，一个完整的克隆需要很多步骤，我一般都是拿质粒测序(阳性克隆），其中你上面的有些列举的步骤顺序不对，所谓测序是主要还是拿出基因的片段长度，要拿全长的话，还要继续做RACE。有啥问题共同学习。 |
2楼2012-10-11 17:15:09
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4楼2012-10-11 17:56:08
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6楼2012-10-12 10:52:12
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1.设计引物扩目的片段。为了保证你引物序列及其序列的正确性，建议先连接T载体。 2.用回收的目的片段连T载体（如果你用的试剂没有加A的功能要额外加A),连接过夜（具体操作得看你用试剂） 3。将连接产物转化到大肠杆菌，并涂板，长出单克隆后，调克隆摇菌检测，有带的话送测序。 4.测序是为了确保序列的准确性，如完全正确，则抽质粒。 5.将目的片段的质粒和空载体的质粒同时酶切，让他们形成以互补的粘性末端，然后跑胶，回收 6.用连接酶将产物连接，转化到大肠杆菌，涂板，张单克隆，挑克隆，摇菌 7.做菌液pcr，有带的话就可以保存菌液，做后面的工作，不过为了更确定目的片段已经连上目的载体，你可以将质粒重新做个酶切，如果是两条带就对了。 这样载体就算是构建好了，希望会对你有帮助 |
7楼2012-10-16 23:38:30
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