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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 分子克隆转化技术流程
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银虫 (著名写手)

[求助] 求助 分子克隆转化技术流程

1.引物设计获得扩增片段
2.回收片段
3.回收片段加A
4.载体酶切
5.加A后片段和酶切后的载体进行连接
6.连接产物转化大肠杆菌
7.单克隆菌株检测
8.测序。测序是把阳性克隆的菌，摇菌后所得的菌拿去测序吗？测序是怎么验证呢？
9.测序确认了，接着提菌液里的质粒。
10. 转化。这里不懂了！有什么摇菌  酶切  鉴定......  求高人指点！
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1楼 2012-10-11 16:42:24
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zhangby2002

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
review: 金币+20, ★★★很有帮助, 5 2012-10-12 08:07:15
摇菌是指为了在平板培养基上培养菌落以便提取克隆（防止假阳性），
酶切鉴定是指的你的质粒是否连接到载体上，没连接上说明失败。具体测序你可以用菌液，有的为了省钱用PCR产物，这些你可以参阅，一个完整的克隆需要很多步骤，我一般都是拿质粒测序(阳性克隆），其中你上面的有些列举的步骤顺序不对，所谓测序是主要还是拿出基因的片段长度，要拿全长的话，还要继续做RACE。有啥问题共同学习。
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业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
2楼2012-10-11 17:15:09
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银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangby2002 at 2012-10-11 17:15:09
摇菌是指为了在平板培养基上培养菌落以便提取克隆（防止假阳性），
酶切鉴定是指的你的质粒是否连接到载体上，没连接上说明失败。具体测序你可以用菌液，有的为了省钱用PCR产物，这些你可以参阅，一个完整的克隆需 ...

哪里不对你帮我指出吧   还有没补的实验目的。你把你的列出来也行  麻烦了！
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3楼2012-10-11 17:24:50
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asdkingstar

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的目的是做什么？克隆文库？PCR-DGGE?ARDRA分型？还是其他的？
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爱是浅浅的喜欢，喜欢是浅浅的爱。
4楼2012-10-11 17:56:08
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银虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by asdkingstar at 2012-10-11 17:56:08
你的目的是做什么？克隆文库？PCR-DGGE?ARDRA分型？还是其他的？

克隆文库
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5楼2012-10-12 08:06:52
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asdkingstar

金虫 (正式写手)
你既然需要在扩增片段后加A，说明你用的是高保真酶。
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爱是浅浅的喜欢，喜欢是浅浅的爱。
6楼2012-10-12 10:52:12
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as023

银虫 (小有名气)
1.设计引物扩目的片段。为了保证你引物序列及其序列的正确性，建议先连接T载体。
2.用回收的目的片段连T载体（如果你用的试剂没有加A的功能要额外加A),连接过夜（具体操作得看你用试剂）
3。将连接产物转化到大肠杆菌，并涂板，长出单克隆后，调克隆摇菌检测，有带的话送测序。
4.测序是为了确保序列的准确性，如完全正确，则抽质粒。
5.将目的片段的质粒和空载体的质粒同时酶切，让他们形成以互补的粘性末端，然后跑胶，回收
6.用连接酶将产物连接，转化到大肠杆菌，涂板，张单克隆，挑克隆，摇菌
7.做菌液pcr，有带的话就可以保存菌液，做后面的工作，不过为了更确定目的片段已经连上目的载体，你可以将质粒重新做个酶切，如果是两条带就对了。
这样载体就算是构建好了，希望会对你有帮助
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7楼2012-10-16 23:38:30
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银虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by as023 at 2012-10-16 23:38:30
1.设计引物扩目的片段。为了保证你引物序列及其序列的正确性，建议先连接T载体。
2.用回收的目的片段连T载体（如果你用的试剂没有加A的功能要额外加A),连接过夜（具体操作得看你用试剂）
3。将连接产物转化到大肠 ...

非常感谢大侠指点！还是有些疑问  呵呵
第2步和第6步有什么区别？

还有第三步和第6步都是转化大肠杆菌    又有什么不同呢？
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8楼2012-10-17 13:30:06
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as023

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by review at 2012-10-17 13:30:06
非常感谢大侠指点！还是有些疑问  呵呵
第2步和第6步有什么区别？

还有第三步和第6步都是转化大肠杆菌    又有什么不同呢？...

2步的T载体不是表达载体，6步是表达载体，
3步连大肠杆菌了为了测序，确认序列的正确性
6步，是将目的片段连接到表达载体上，转大肠杆菌，以便保存菌液，方便后续工作，比如再转其他的的菌株如GV3101转化拟南芥用的话，直接从大肠杆菌中提取质粒去转就可以，大肠杆菌保存及提取质粒比较容易操作，而从农杆菌中不好提取质粒
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9楼2012-10-17 20:06:40
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