| 查看: 3173 | 回复: 8 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
review银虫 (著名写手)
|
[求助]
求助 分子克隆转化技术流程
|
||
|
1.引物设计获得扩增片段 2.回收片段 3.回收片段加A 4.载体酶切 5.加A后片段和酶切后的载体进行连接 6.连接产物转化大肠杆菌 7.单克隆菌株检测 8.测序。测序是把阳性克隆的菌，摇菌后所得的菌拿去测序吗？测序是怎么验证呢？ 9.测序确认了，接着提菌液里的质粒。 10. 转化。这里不懂了！有什么摇菌 酶切 鉴定...... 求高人指点！ |
回复此楼» 猜你喜欢
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用
已经有0人回复
-
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有74人回复
-
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？
已经有0人回复
-
TYK2/JAK1 双靶点工具化合物 Brepocitinib：激酶选择性、研究进展与实验应用全解析
已经有0人回复
-
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质控实录：从一张HPLC图谱读懂纯度与稳定性
已经有0人回复
-
恩诺沙星（Enrofloxacin）科研解析：分子特征、LC-MS/MS 检测与实验室使用要点
已经有0人回复
-
Calderasib理化性质与实验操作技术笔记
已经有0人回复
-
RMC-6291怎么用？RAS(ON) 三重复合物工具化合物的实验室实操要点
已经有0人回复
-
苯并呋咱全解析：NBD 荧光衍生化试剂母核的化学特性与实验室应用
已经有0人回复
-
生物质炭与活化剂氢氧化钾混合注意事项
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 转化后阳性克隆长得比较慢是什么原因？！
已经有18人回复
- 【求助/交流】分子克隆 双tag
已经有3人回复
- 转化 克隆 代做
已经有3人回复
- 求助关于转化的问题？
已经有22人回复
- 【求助】微生物转化的问题
已经有8人回复
- 克隆基因和载体连接后转化至大肠杆菌，为什么每次涂板都是空平板没有菌落？
已经有17人回复
- 【求助/交流】分子克隆
已经有15人回复
- 【求助/交流】请各位帮忙指点一下！约8000多碱基对的克隆子的转化需要什么转化技术比�
已经有4人回复
- 【求助/交流】分子克隆后M13引物PCR扩增
已经有32人回复
- 【求助/交流】分子克隆实验指南有英文版的吗？
已经有7人回复
- 【求助/交流】分子克隆，建库
已经有10人回复
- 【求助/交流】有关分子克隆发生突变的疑惑
已经有9人回复
|
1.设计引物扩目的片段。为了保证你引物序列及其序列的正确性，建议先连接T载体。 2.用回收的目的片段连T载体（如果你用的试剂没有加A的功能要额外加A),连接过夜（具体操作得看你用试剂） 3。将连接产物转化到大肠杆菌，并涂板，长出单克隆后，调克隆摇菌检测，有带的话送测序。 4.测序是为了确保序列的准确性，如完全正确，则抽质粒。 5.将目的片段的质粒和空载体的质粒同时酶切，让他们形成以互补的粘性末端，然后跑胶，回收 6.用连接酶将产物连接，转化到大肠杆菌，涂板，张单克隆，挑克隆，摇菌 7.做菌液pcr，有带的话就可以保存菌液，做后面的工作，不过为了更确定目的片段已经连上目的载体，你可以将质粒重新做个酶切，如果是两条带就对了。 这样载体就算是构建好了，希望会对你有帮助 |
7楼2012-10-16 23:38:30
zhangby2002
银虫 (小有名气)
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 450.6
- 散金: 296
- 红花: 1
- 帖子: 191
- 在线: 116.8小时
- 虫号: 1187097
- 注册: 2011-01-10
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
review: 金币+20, ★★★很有帮助, 5 2012-10-12 08:07:15
感谢参与，应助指数 +1
review: 金币+20, ★★★很有帮助, 5 2012-10-12 08:07:15
|
摇菌是指为了在平板培养基上培养菌落以便提取克隆（防止假阳性）， 酶切鉴定是指的你的质粒是否连接到载体上，没连接上说明失败。具体测序你可以用菌液，有的为了省钱用PCR产物，这些你可以参阅，一个完整的克隆需要很多步骤，我一般都是拿质粒测序(阳性克隆），其中你上面的有些列举的步骤顺序不对，所谓测序是主要还是拿出基因的片段长度，要拿全长的话，还要继续做RACE。有啥问题共同学习。 |
2楼2012-10-11 17:15:09
review
银虫 (著名写手)
- 应助: 24 (小学生)
- 金币: 903.6
- 散金: 57
- 帖子: 1355
- 在线: 265.5小时
- 虫号: 988088
- 注册: 2010-04-02
- 专业: 植物资源学
3楼2012-10-11 17:24:50
asdkingstar
金虫 (正式写手)
- 应助: 21 (小学生)
- 金币: 1418.5
- 红花: 4
- 帖子: 705
- 在线: 49.5小时
- 虫号: 1937569
- 注册: 2012-08-13
- 性别: MM
- 专业: 系统生物学
4楼2012-10-11 17:56:08
10