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慕容清婉

木虫 (小有名气)

[求助] 定点突变,转化后没有长出克隆 已有4人参与

各位前辈,最近在做定点突变,单个点突变,一共做了4个(544,719,721,724位),酶是takara的primestar,质粒全长是9K,PCR(退火温度是55℃)后进行DpnI酶切,转化至DH5α,第二天只有724位突变的长出了单克隆。另外三个没有长出单克隆,我分析是PCR步骤有问题,就把退火温度降到了53℃,这次转化后仍然没有单克隆长出。
新手第一次进行定点突变,现在不知道接下来该从哪方面入手?望各位前辈不吝赐教,感激不尽!
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慕容清婉

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-10-16 10:12:21
突变PCR产物跑个琼脂糖胶,看看有没有扩增出来,如果扩增出来了,有可能是你的转化或者感受态细胞出问题了。建议做转化的时候做个PUC19质粒的转化对照,确保感受态细胞没有问题。

感受态应该是没问题,之前一直用来做转化,这次做的四个突变,有一个成功了,但是另外三个没长出克隆。怀疑是没p出来
3楼2014-10-16 10:21:44
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查看全部 7 个回答

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-10-16 11:14:54
突变PCR产物跑个琼脂糖胶,看看有没有扩增出来,如果扩增出来了,有可能是你的转化或者感受态细胞出问题了。建议做转化的时候做个PUC19质粒的转化对照,确保感受态细胞没有问题。
rainwater
2楼2014-10-16 10:12:21
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wshi85

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
慕容清婉(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-01 19:23:12
这个很可能是你设计的引物不好!建议你重新设计引物做点突变,最好是重新设计引物pcr出来在构建到载体上,这种效率也是不错的
很久没在虫虫上漂游了,觉得回归虫虫!
4楼2014-10-16 22:50:24
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR后先取样跑胶检测下,阳性再酶切,转化。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
5楼2014-10-16 23:39:50
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