| 查看: 3417 | 回复: 7 | ||
austin2008铁杆木虫 (著名写手)
|
[求助]
能在芽孢杆菌中复制的温敏型复制子194ts片段连接T载体多次测序都发生突变 已有1人参与
|
|
问题描述：本人想构建一个温敏型的穿梭质粒，在NCBI上找到pE194质粒上的复制子序列194ts（GenBank: M17811.1），然后送到苏州某公司合成1138 bp 的片段，结果该公司两次装载pUC57载体失败，主要是原因是，这个片段装到pUC57载体中总是发生各种突变，他们测序了7个克隆子后测序发现2个双峰，5个突变，而且每个突变的突变位置都不一样，最终提供给我们的是合成的组装好的PCR产物和空的pUC57载体，给我们的解释是我们合成的194ts片段是个复制子可能会与载体上大肠杆菌的ori发生冲突，复制过程中产生突变。我当时对这个解释是将信将疑，等拿到材料了准备验证一下，无论是我们连接pMD19T simple载体还是pUC57载体，做了3次，每次送3-4个阳性克隆子去测序，结果每次都有突变，而且每次突变的点不一样，我们将这些突变的温敏复制子酶切后，连入穿梭载体替换芽孢杆菌的复制区域，发现转化2次枯草芽孢杆菌，每一种都没有长出阳性克隆子（注：对照质粒转化长了，枯草芽孢杆菌感受态细胞没问题）。 我个人分析了一下，可能有以下2种原因：（1）这个温敏型复制子194ts连入T载体质粒不稳定，可能是连入的方向不好；（2）大肠杆菌的ori和这个194ts片段在一个载体中时在质粒复制过程中出现问题；问了好些做分子生物学的人都不知道其中出了什么问题，请了解情况的高手赐教，不胜感激……！ |
回复此楼» 猜你喜欢
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有154人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有11人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 工程菌在疾病治疗领域的发展
已经有3人回复
- 世界卫生组织对转基因的解读
已经有4人回复
- 2010中科院微生物考博真题答案
已经有39人回复
- 求芽孢杆菌穿梭质粒以及基因敲除经验
已经有15人回复
- 革兰氏阳性菌接合 出问题了
已经有4人回复
- pe194质粒中温敏复制子的克隆与基因敲除用穿梭质粒的构建问题
已经有1人回复
- 大肠和枯草中的质粒的不同
已经有11人回复
- 适于在枯草芽孢杆菌中复制的温敏型质粒
已经有0人回复
- 【求助/交流】pIC333质粒能在巨大芽孢杆菌里面自主复制吗？
已经有3人回复
- 【前沿】火星探索可使其表面遭到地球微生物污染
已经有1人回复
huangrui1988 
铜虫 (小有名气)
- 应助: 73 (初中生)
- 金币: 1727.8
- 散金: 20
- 红花: 2
- 帖子: 201
- 在线: 210.1小时
- 虫号: 953497
- 注册: 2010-02-07
- 专业: 微生物资源与分类学
2楼2014-06-12 22:48:51
austin2008
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 22 (小学生)
- 金币: 5184.4
- 散金: 100
- 红花: 2
- 帖子: 1812
- 在线: 259.5小时
- 虫号: 368365
- 注册: 2007-05-11
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2014-06-12 23:42:48
huangrui1988
铜虫 (小有名气)
- 应助: 73 (初中生)
- 金币: 1727.8
- 散金: 20
- 红花: 2
- 帖子: 201
- 在线: 210.1小时
- 虫号: 953497
- 注册: 2010-02-07
- 专业: 微生物资源与分类学
4楼2014-06-13 00:02:40
weishengsu5
木虫 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 2526
- 红花: 1
- 帖子: 469
- 在线: 374.2小时
- 虫号: 1016558
- 注册: 2010-05-12
- 性别: GG
- 专业: 生物化工与食品化工
5楼2015-01-08 17:06:42
austin2008
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 22 (小学生)
- 金币: 5184.4
- 散金: 100
- 红花: 2
- 帖子: 1812
- 在线: 259.5小时
- 虫号: 368365
- 注册: 2007-05-11
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
6楼2015-01-08 22:35:27
7楼2015-03-31 13:55:59
weishengsu5
木虫 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 2526
- 红花: 1
- 帖子: 469
- 在线: 374.2小时
- 虫号: 1016558
- 注册: 2010-05-12
- 性别: GG
- 专业: 生物化工与食品化工
8楼2018-04-20 15:16:57
40