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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 能在芽孢杆菌中复制的温敏型复制子194ts片段连接T载体多次测序都发生突变
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 能在芽孢杆菌中复制的温敏型复制子194ts片段连接T载体多次测序都发生突变 已有1人参与

问题描述：本人想构建一个温敏型的穿梭质粒，在NCBI上找到pE194质粒上的复制子序列194ts（GenBank: M17811.1），然后送到苏州某公司合成1138 bp 的片段，结果该公司两次装载pUC57载体失败，主要是原因是，这个片段装到pUC57载体中总是发生各种突变，他们测序了7个克隆子后测序发现2个双峰，5个突变，而且每个突变的突变位置都不一样，最终提供给我们的是合成的组装好的PCR产物和空的pUC57载体，给我们的解释是我们合成的194ts片段是个复制子可能会与载体上大肠杆菌的ori发生冲突，复制过程中产生突变。我当时对这个解释是将信将疑，等拿到材料了准备验证一下，无论是我们连接pMD19T simple载体还是pUC57载体，做了3次，每次送3-4个阳性克隆子去测序，结果每次都有突变，而且每次突变的点不一样，我们将这些突变的温敏复制子酶切后，连入穿梭载体替换芽孢杆菌的复制区域，发现转化2次枯草芽孢杆菌，每一种都没有长出阳性克隆子（注：对照质粒转化长了，枯草芽孢杆菌感受态细胞没问题）。
      我个人分析了一下，可能有以下2种原因：（1）这个温敏型复制子194ts连入T载体质粒不稳定，可能是连入的方向不好；（2）大肠杆菌的ori和这个194ts片段在一个载体中时在质粒复制过程中出现问题；问了好些做分子生物学的人都不知道其中出了什么问题，请了解情况的高手赐教，不胜感激……！
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1楼 2014-06-12 21:27:43
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康二郎

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by austin2008 at 2015-01-08 22:35:27
构建成功了...

最近导师也让我直接让公司合成PE194的温度敏感性复制子，然后连到puc58或puc18上去。看到你的帖子后让我很犹豫此方法的可行性，你最后是怎么构建成功的呢？以前为什么老是突变呢？
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7楼2015-03-31 13:55:59
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
austin2008: 金币+3, ★有帮助, 好的，我看看文献去，但是那些突变是不影响复制功能的呢？ 2014-06-12 23:44:43
你看了pE194质粒的相关文章就会发现，他本来自己就是会突变的，包括移码突变。。。
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2楼2014-06-12 22:48:51
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-06-12 22:48:51
你看了pE194质粒的相关文章就会发现，他本来自己就是会突变的，包括移码突变。。。

那怎么知道那些突变是不影响功能的呢？
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优秀是一种习惯;生命是一种过程;放弃是一种智慧;缺点是一种恩惠!
3楼2014-06-12 23:42:48
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by austin2008 at 2014-06-12 23:42:48
那怎么知道那些突变是不影响功能的呢？...

随机的。。。。你看看对你的实验有没有影响就知道啦。
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4楼2014-06-13 00:02:40
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