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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)

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专业: 微生物生理与生物化学

[求助] 能在芽孢杆菌中复制的温敏型复制子194ts片段连接T载体多次测序都发生突变已有1人参与

问题描述：本人想构建一个温敏型的穿梭质粒，在NCBI上找到pE194质粒上的复制子序列194ts（GenBank: M17811.1），然后送到苏州某公司合成1138 bp 的片段，结果该公司两次装载pUC57载体失败，主要是原因是，这个片段装到pUC57载体中总是发生各种突变，他们测序了7个克隆子后测序发现2个双峰，5个突变，而且每个突变的突变位置都不一样，最终提供给我们的是合成的组装好的PCR产物和空的pUC57载体，给我们的解释是我们合成的194ts片段是个复制子可能会与载体上大肠杆菌的ori发生冲突，复制过程中产生突变。我当时对这个解释是将信将疑，等拿到材料了准备验证一下，无论是我们连接pMD19T simple载体还是pUC57载体，做了3次，每次送3-4个阳性克隆子去测序，结果每次都有突变，而且每次突变的点不一样，我们将这些突变的温敏复制子酶切后，连入穿梭载体替换芽孢杆菌的复制区域，发现转化2次枯草芽孢杆菌，每一种都没有长出阳性克隆子（注：对照质粒转化长了，枯草芽孢杆菌感受态细胞没问题）。
我个人分析了一下，可能有以下2种原因：（1）这个温敏型复制子194ts连入T载体质粒不稳定，可能是连入的方向不好；（2）大肠杆菌的ori和这个194ts片段在一个载体中时在质粒复制过程中出现问题；问了好些做分子生物学的人都不知道其中出了什么问题，请了解情况的高手赐教，不胜感激……！

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