应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 能在芽孢杆菌中复制的温敏型复制子194ts片段连接T载体多次测序都发生突变
51/1返回列表
查看: 3172  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

austin2008

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 能在芽孢杆菌中复制的温敏型复制子194ts片段连接T载体多次测序都发生突变 已有1人参与

问题描述：本人想构建一个温敏型的穿梭质粒，在NCBI上找到pE194质粒上的复制子序列194ts（GenBank: M17811.1），然后送到苏州某公司合成1138 bp 的片段，结果该公司两次装载pUC57载体失败，主要是原因是，这个片段装到pUC57载体中总是发生各种突变，他们测序了7个克隆子后测序发现2个双峰，5个突变，而且每个突变的突变位置都不一样，最终提供给我们的是合成的组装好的PCR产物和空的pUC57载体，给我们的解释是我们合成的194ts片段是个复制子可能会与载体上大肠杆菌的ori发生冲突，复制过程中产生突变。我当时对这个解释是将信将疑，等拿到材料了准备验证一下，无论是我们连接pMD19T simple载体还是pUC57载体，做了3次，每次送3-4个阳性克隆子去测序，结果每次都有突变，而且每次突变的点不一样，我们将这些突变的温敏复制子酶切后，连入穿梭载体替换芽孢杆菌的复制区域，发现转化2次枯草芽孢杆菌，每一种都没有长出阳性克隆子（注：对照质粒转化长了，枯草芽孢杆菌感受态细胞没问题）。
      我个人分析了一下，可能有以下2种原因：（1）这个温敏型复制子194ts连入T载体质粒不稳定，可能是连入的方向不好；（2）大肠杆菌的ori和这个194ts片段在一个载体中时在质粒复制过程中出现问题；问了好些做分子生物学的人都不知道其中出了什么问题，请了解情况的高手赐教，不胜感激……！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
优秀是一种习惯;生命是一种过程;放弃是一种智慧;缺点是一种恩惠!
1楼 2014-06-12 21:27:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weishengsu5

木虫 (正式写手)
请教，您这个温敏型的穿梭质粒后来构建成功了吗？
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2015-01-08 17:06:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

huangrui1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
austin2008: 金币+3, ★有帮助, 好的，我看看文献去，但是那些突变是不影响复制功能的呢？ 2014-06-12 23:44:43
你看了pE194质粒的相关文章就会发现，他本来自己就是会突变的，包括移码突变。。。
赞一下 回复此楼
2楼2014-06-12 22:48:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

austin2008

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by huangrui1988 at 2014-06-12 22:48:51
你看了pE194质粒的相关文章就会发现，他本来自己就是会突变的，包括移码突变。。。

那怎么知道那些突变是不影响功能的呢？
赞一下 回复此楼
优秀是一种习惯;生命是一种过程;放弃是一种智慧;缺点是一种恩惠!
3楼2014-06-12 23:42:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huangrui1988

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by austin2008 at 2014-06-12 23:42:48
那怎么知道那些突变是不影响功能的呢？...

随机的。。。。你看看对你的实验有没有影响就知道啦。
赞一下 回复此楼
4楼2014-06-13 00:02:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 化学工程321分求调剂 +13 大米饭！ 2026-03-15 16/800 2026-03-18 09:48 by zhukairuo
[考研] 301求调剂 +9 yy要上岸呀 2026-03-17 9/450 2026-03-18 08:58 by 无际的草原
[考研] 085601材料工程专硕求调剂 +5 慕寒mio 2026-03-16 5/250 2026-03-17 21:31 by hmn_wj
[考研] 材料与化工求调剂 +6 为学666 2026-03-16 6/300 2026-03-17 20:15 by peike
[考研] 341求调剂 +5 捣蛋猪猪 2026-03-11 7/350 2026-03-17 19:09 by 捣蛋猪猪
[硕博家园] 湖北工业大学 生命科学与健康学院-课题组招收2026级食品/生物方向硕士 +3 1喜春8 2026-03-17 5/250 2026-03-17 17:18 by ber川cool子
[考研] 290求调剂 +3 p asserby. 2026-03-15 4/200 2026-03-17 16:35 by wangkm
[考研] 0854控制工程 359求调剂 可跨专业 +3 626776879 2026-03-14 9/450 2026-03-16 17:42 by 626776879
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +7 Ncdx123456 2026-03-13 8/400 2026-03-16 12:15 by karry wen
[考研] 085601材料工程315分求调剂 +3 yang_0104 2026-03-15 3/150 2026-03-15 10:58 by peike
[考研] 复试调剂 +4 z1z2z3879 2026-03-14 5/250 2026-03-14 16:30 by JourneyLucky
[考研] 297求调剂 +4 学海漂泊 2026-03-13 4/200 2026-03-14 11:51 by 热情沙漠
[考研] 308 085701 四六级已过求调剂 +7 温乔乔乔乔 2026-03-12 14/700 2026-03-14 10:49 by JourneyLucky
[考研] 266求调剂 +4 学员97LZgn 2026-03-13 4/200 2026-03-14 08:37 by zhukairuo
[考研] 26调剂/材料科学与工程/总分295/求收留 +9 2026调剂侠 2026-03-12 9/450 2026-03-13 20:46 by 18595523086
[考研] 求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-12 5/250 2026-03-13 18:31 by ms629
[考研] 0703化学求调剂 +7 绿豆芹菜汤 2026-03-12 7/350 2026-03-13 17:25 by njzyff
[考研] 310求调剂 +3 【上上签】 2026-03-11 3/150 2026-03-13 16:16 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +7 18880831720 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:10 by JourneyLucky
[考研] 0817化学工程与技术考研312分调剂 +3 T123 tt 2026-03-12 3/150 2026-03-13 10:49 by houyaoxu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭