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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 转化后平板不长菌
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最末那抹夕阳

新虫 (初入文坛)

[求助] 转化后平板不长菌 已有7人参与

用的pMD18-T载体，空载体长菌了，control insert也长了，但是长的不多，就是目的片段的连接产物一点都没长，是不是用的PCR反应的taq酶的问题，我用的是LA Taq酶
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1楼 2014-04-21 10:56:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jonew

木虫 (正式写手)

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★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-04-22 13:34:28
空载体长菌了 说明抗生素失效了  目的片段的连接产物没有长可能是没有连上（但是空载也可以长啊）这个。。。  control insert也长了说明你的载体 感受态没有问题 lataq 是ta克隆  你这个纠结。。。。
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借口很贱，，，
9楼2014-04-21 16:56:03
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wushm388

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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最末那抹夕阳(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-21 12:25:20
目的片段的加入量合适吗？也就是vector与外源片段之间的摩尔比如何？另外你的目的片段足够纯净吗？
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2楼2014-04-21 12:23:09
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kueradi

金虫 (小有名气)

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★ ★
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最末那抹夕阳(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-04-23 23:49:25
目的片段的长度是多少呢，我之前做的300多，七八百的很容易做，但一千做了好几次就是不成功呀。长度还是蛮影响结果的。
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3楼2014-04-21 12:39:01
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呀薯条

金虫 (小有名气)

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感谢参与，应助指数 +1
我之前做了好几遍，也一直没长。你的连接量是多少？回收的产物可以测下浓度看看
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4楼2014-04-21 15:22:11
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-22 13:34:48
我之前做的连接转化也没有长，后来测了一下浓度，发现酶切质粒的浓度太低，给你提供一个可能性，你试试。
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5楼2014-04-21 15:45:04
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最末那抹夕阳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 夏末忆雪 at 2014-04-21 15:45:04
我之前做的连接转化也没有长，后来测了一下浓度，发现酶切质粒的浓度太低，给你提供一个可能性，你试试。

我不酶切，直接PCR扩增之后就进行连接转化，你酶切的目的片段是多少啊
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6楼2014-04-21 16:07:00
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最末那抹夕阳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kueradi at 2014-04-21 12:39:01
目的片段的长度是多少呢，我之前做的300多，七八百的很容易做，但一千做了好几次就是不成功呀。长度还是蛮影响结果的。

我的193bp
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7楼2014-04-21 16:08:06
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最末那抹夕阳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 呀薯条 at 2014-04-21 15:22:11
我之前做了好几遍，也一直没长。你的连接量是多少？回收的产物可以测下浓度看看

10微升体系，0.5ul载体，4.5ulPCR产物，5ul solution Ⅰ，回收的产物怎么测浓度啊
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8楼2014-04-21 16:09:48
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yichunh

木虫 (正式写手)
连接前加A了么？应该是没连接上~
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10楼2014-04-21 18:35:03
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