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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 转化后平板不长菌
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JICK159

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by yichunh at 2014-04-21 18:35:03
连接前加A了么？应该是没连接上~

一看你就外行
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11楼2014-04-21 19:07:18
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JICK159

木虫 (正式写手)
哥们，你太搞了
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12楼2014-04-21 19:07:36
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jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
最末那抹夕阳: 金币+1, ★有帮助 2014-04-22 09:46:28
引用回帖:
8楼: Originally posted by 最末那抹夕阳 at 2014-04-21 16:09:48
10微升体系，0.5ul载体，4.5ulPCR产物，5ul solution Ⅰ，回收的产物怎么测浓度啊...

楼主这个连接体系没问题，我也常用这样的比例。
最关键的是你的PCR产物回收后浓度如何？电泳3uL看看吧，如果能看到带，应该很好连进去的。
193bp长度，可以用Ex Taq扩增效率会更好, 当然，用LA Taq也行。
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13楼2014-04-21 23:36:18
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呀薯条

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
最末那抹夕阳: 金币+1 2014-04-22 09:46:40
引用回帖:
8楼: Originally posted by 最末那抹夕阳 at 2014-04-21 16:09:48
10微升体系，0.5ul载体，4.5ulPCR产物，5ul solution Ⅰ，回收的产物怎么测浓度啊...

我们实验室有个微量测定仪。也有同学是用少量产物回收再重新跑次PCR，然后根据与MARKER比对亮度，来大概推测下浓度，或者你也可以直接测分光光度计，测完260和280后，有个公式，可以得出其浓度。我前几次浓度就是太低了，第一次才六点几，后来有次是12点多，最后这次终于好点，是八十多
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14楼2014-04-22 08:55:03
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呀薯条

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by yichunh at 2014-04-21 18:35:03
连接前加A了么？应该是没连接上~

要是用taq酶的话，一般都是可以自动加尾的
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15楼2014-04-22 08:55:51
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最末那抹夕阳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by jukongka at 2014-04-21 23:36:18
楼主这个连接体系没问题，我也常用这样的比例。
最关键的是你的PCR产物回收后浓度如何？电泳3uL看看吧，如果能看到带，应该很好连进去的。
193bp长度，可以用Ex Taq扩增效率会更好, 当然，用LA Taq也行。...

LA Taq能在目的片段末尾加A吗，是不是没连接上
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16楼2014-04-22 09:42:04
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最末那抹夕阳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 呀薯条 at 2014-04-22 08:55:51
要是用taq酶的话，一般都是可以自动加尾的...

LA taq能自动加尾吗
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17楼2014-04-22 09:48:05
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windleakey

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-23 23:49:54
好奢侈，我两千多bp都没用LA taq；
LA taq可以用于TA克隆；
这个实验按理来说不会有啥问题，浓度测不测都行不吧。
一般PCR产物都很浓，就连接体系：1ul pcr产物，1ul T载体，3ul 水，5ul solution1，连一个小时。
转50ul感受态细胞，总会长的。
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18楼2014-04-22 13:30:01
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呀薯条

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by 最末那抹夕阳 at 2014-04-22 09:48:05
LA taq能自动加尾吗...

LA taq 我也没用过。你要不问周围做的比较成功的人借借感受态细胞试试，可能是自己的感受态细胞没制备好。我就是用了次旁边实验室的，菌落PCR也是成功的，他们的感受态细胞是直接买来的
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19楼2014-04-23 18:42:09
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jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫
引用回帖:
17楼: Originally posted by 最末那抹夕阳 at 2014-04-22 09:48:05
LA taq能自动加尾吗...

LA Taq, Ex Taq都会自动加尾。
现在LATaq也不贵的
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20楼2014-04-25 01:18:11
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