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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒导入大肠杆菌导不进去，求高手指点
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saucemale

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒导入大肠杆菌导不进去，求高手指点

在大肠杆菌感受态细胞中已经转入一个质粒，转进去后涂平板也长菌了，现在把长出的菌体做成感受态细胞再转入第二个质粒，转了几次涂平板都不长，请教是什么原因？
（注：这两种质粒分别含有两种不同的抗性，感受态都是新做的）
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1楼 2012-07-17 10:36:10
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回帖置顶 ( 共有1个 )

0301nan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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saucemale: 回帖置顶 2012-07-17 15:02:15
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-17 22:23:49
我认为完全可以两个质粒同时转，然后用双抗性的平板进行筛选，我以前做过双抗性的，同时转的，只要涂板的时候多涂一些就可以了。你这样先转一个是不是在转第一个后细胞已经失去了感受态的性质
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saucemale
5楼2012-07-17 12:43:04
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

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你看看这两个质粒兼容不？只是筛选标记不同还不行，还要看复制其实位点。
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Thank-you，so-blue.
3楼2012-07-17 11:26:12
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普通回帖

healy13

禁虫 (小有名气)
★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-18 13:32:14
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saucemale
2楼2012-07-17 10:55:29
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般都是感受态的问题,或者你的转化条件不行.
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saucemale
coasttocoast。
4楼2012-07-17 11:39:03
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saucemale

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-17 11:39:03
一般都是感受态的问题,或者你的转化条件不行.

感受态每天都是新做的，已经做了5次了，不会每次都不行吧
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6楼2012-07-17 14:52:24
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saucemale

金虫 (小有名气)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by healy13 at 2012-07-17 10:55:29
一个质粒？这是什么概念？怎么可能就只转一个！肯定要一定的浓度，才会有转入的几率！
你不长有几个原因：感受态没做成功，可以买现成的商品化的；抗生素用错；转化条件不行，如冰浴，热击的时间和温度~~~等等~~~~

我的意思是我从公司里购买了TOP感受态细胞，然后做质粒转化，结果第一种质粒转进去了，现在我要把已转入质粒的TOP细胞再做成感受态细胞，转入我的第二种质粒，现在为止已经做了5次了，都没有成功（注：TOP是从公司买的大肠感受态细胞）
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7楼2012-07-17 14:56:49
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saucemale

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 0301nan at 2012-07-17 12:43:04
我认为完全可以两个质粒同时转，然后用双抗性的平板进行筛选，我以前做过双抗性的，同时转的，只要涂板的时候多涂一些就可以了。你这样先转一个是不是在转第一个后细胞已经失去了感受态的性质

我是转进去一种质粒后，看它长出来，验证的确已经转进去以后再把这个菌体做成感受态转第二种质粒的，可是做了好几次就是做不出来，请教啊····
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8楼2012-07-17 14:59:51
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-18 13:32:39
引用回帖:
7楼: Originally posted by saucemale at 2012-07-17 14:56:49
我的意思是我从公司里购买了TOP感受态细胞，然后做质粒转化，结果第一种质粒转进去了，现在我要把已转入质粒的TOP细胞再做成感受态细胞，转入我的第二种质粒，现在为止已经做了5次了，都没有成功（注：TOP是从公司 ...

个人建议啊，将两种质粒一同转化，加双抗，或者只有一种抗性就最好了。因为你将第一种质粒转化进去了，是用的商业化感受态，你第二次再转化的，用的就是你自己做的感受态了，自己做的毕竟赶不上商业化的感受态，所以就影响了你的转化效率。
并且，你将转化后含有质粒的菌来做感受态，容易丢失已经转化进去的质粒。
总之吧，共同转化就结了。嘿嘿
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saucemale
9楼2012-07-17 16:22:11
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liangdouxion

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒的不相容性？看看他们的复制起始位点一样吧？
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毛球
10楼2012-07-17 16:39:24
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