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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒导入大肠杆菌导不进去，求高手指点
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
还是2个质粒起转吧，双抗性筛选。
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11楼2012-07-17 18:57:01
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通缉要饭

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也觉得同时转是最好的！
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12楼2012-07-17 19:21:34
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-18 13:32:59
查一下你的两个质粒的兼容性：一般来说，两个质粒能够共存的前提是这两个质粒的复制原点是不同的（常见的复制原点包括pBR322 ori, CDF ori 等等）。实验室常用的复制原点都来源于pBR322 ori, ，因而大部分是不能共存的，即使抗性不同，也不能筛选到双抗性的菌株，除非，你使用的两个质粒的复制原点可以兼容（如pBR322 ori 和CDF ori就可以兼容，能够共存）
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13楼2012-07-17 21:31:26
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saucemale

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-17 16:22:11
个人建议啊，将两种质粒一同转化，加双抗，或者只有一种抗性就最好了。因为你将第一种质粒转化进去了，是用的商业化感受态，你第二次再转化的，用的就是你自己做的感受态了，自己做的毕竟赶不上商业化的感受态，所 ...

因为第二种质粒要连接新的片段在上面，商品化的感受态已经用完了，两个质粒同时转，效率很低，总之我会试试的，谢谢你的建议····
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14楼2012-07-18 10:21:09
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123n

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议：两种质粒一块转，然后分别筛选（首先在一种抗生素上筛，挑单克隆并摇菌，然后涂板在另一种抗生素上筛！！）这样会效果好一些~~~~
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15楼2012-07-18 10:26:22
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saucemale

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-17 11:39:03
一般都是感受态的问题,或者你的转化条件不行.

感受态每天都是新做的，做了好多次，应该没有问题的，我的转化条件是100ul的感受态细胞加1ul质粒，冰上放置30min，42℃热击90s，冰上放置2min，加900ulLB，37℃摇床180rpm/min一个小时，涂有相应抗性的平板，就是不长菌啊，主要是做感受态的菌之前已经转进去一种质粒，再用这个菌做成感受态会丢失之前的质粒嘛？
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16楼2012-07-18 10:40:44
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tianchi2952

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by susizheng at 2012-07-17 11:26:12
你看看这两个质粒兼容不？只是筛选标记不同还不行，还要看复制其实位点。

这才回答到点子上！质粒不兼容情况最有可能......
还有就是双抗筛选就ok了.....
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益学善用
17楼2013-07-04 20:25:25
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