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reallpf

木虫 (正式写手)

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还是2个质粒起转吧,双抗性筛选。
11楼2012-07-17 18:57:01
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通缉要饭

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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我也觉得同时转是最好的!
12楼2012-07-17 19:21:34
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-18 13:32:59
查一下你的两个质粒的兼容性:一般来说,两个质粒能够共存的前提是这两个质粒的复制原点是不同的(常见的复制原点包括pBR322 ori, CDF ori 等等)。实验室常用的复制原点都来源于pBR322 ori, ,因而大部分是不能共存的,即使抗性不同,也不能筛选到双抗性的菌株,除非,你使用的两个质粒的复制原点可以兼容(如pBR322 ori 和CDF ori就可以兼容,能够共存)
13楼2012-07-17 21:31:26
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saucemale

金虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-17 16:22:11
个人建议啊,将两种质粒一同转化,加双抗,或者只有一种抗性就最好了。因为你将第一种质粒转化进去了,是用的商业化感受态,你第二次再转化的,用的就是你自己做的感受态了,自己做的毕竟赶不上商业化的感受态,所 ...

因为第二种质粒要连接新的片段在上面,商品化的感受态已经用完了,两个质粒同时转,效率很低,总之我会试试的,谢谢你的建议····
14楼2012-07-18 10:21:09
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123n

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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建议:两种质粒一块转,然后分别筛选(首先在一种抗生素上筛,挑单克隆并摇菌,然后涂板在另一种抗生素上筛!!)这样会效果好一些~~~~
15楼2012-07-18 10:26:22
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saucemale

金虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-17 11:39:03
一般都是感受态的问题,或者你的转化条件不行.

感受态每天都是新做的,做了好多次,应该没有问题的,我的转化条件是100ul的感受态细胞加1ul质粒,冰上放置30min,42℃热击90s,冰上放置2min,加900ulLB,37℃摇床180rpm/min一个小时,涂有相应抗性的平板,就是不长菌啊,主要是做感受态的菌之前已经转进去一种质粒,再用这个菌做成感受态会丢失之前的质粒嘛?
16楼2012-07-18 10:40:44
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tianchi2952

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by susizheng at 2012-07-17 11:26:12
你看看这两个质粒兼容不?只是筛选标记不同还不行,还要看复制其实位点。

这才回答到点子上!质粒不兼容情况最有可能......
还有就是双抗筛选就ok了.....
益学善用
17楼2013-07-04 20:25:25
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