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feitianrenwo木虫 (著名写手)
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透析袋 透析回收BAC文库所需大片段DNA的详细操作流程
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求助：利用透析袋透析回收BAC文库所需大片段DNA的详细操作流程是怎样的？ （1）回收的DNA片段在50kb以上，有什么样品牌什么范围的透析袋？ （2）低熔点琼脂糖脉冲电泳，切下所需片段范围的凝胶，放入处理好的透析袋中，留多大的空间？用什么溶液透析？需要进行电泳透析吗？透析多长时间？透析完毕后，透析袋内的溶液就是自己所要DNA片段吗？如果溶液较多，也就是回收的DNA浓度太低，如何处理？ |
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【答案】应助回帖
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scelab(金币+3): 谢谢参与 2011-04-27 08:36:12
feitianrenwo(金币+30): 非常感谢 2011-04-27 21:26:50
scelab(金币+3): 谢谢参与 2011-04-27 08:36:12
feitianrenwo(金币+30): 非常感谢 2011-04-27 21:26:50
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2.2.2.3 电洗脱法回收DNA片段[176] （1）透析袋的处理 ①将透析袋切成长约10~20 cm的小段。 ②将透析袋在含2%（W/V）NaHCO3、1 mM EDTA（pH 8.0）溶液中煮沸10分钟。 ③用蒸馏水彻底冲洗透析袋内外壁。 ④在1 mM EDTA溶液中（pH 8.0）煮沸10分钟。 ⑤自然冷却，透析袋连同 EDTA溶液贮存于4 ℃（贮存期间，应始终让透析袋浸入溶液，以防干燥）。 ⑥使用前，用无菌蒸馏水充分冲洗袋的内外壁。 （2）将需回收的DNA进行凝胶电泳，使目标片段与其他大小的片段分离。 （3）凝胶染色后，在紫外灯下用刀片切下含有目的DNA片段的胶条。 （4）将透析袋一端封紧，并将透析袋装满1×TAE，然后将所切胶条放入透析袋中。 （5）倒掉多余的缓冲液（只留100~150 μl左右），夹紧另一端，注意袋内不能留有气泡。 （6） 将含有胶条的透析袋放在1×TAE（或0.5×TBE）电泳槽中，用4~5 V/cm的电压电泳1~2个小时。 （7） 电泳结束前，更换电极，电泳1分钟。 （8） 打开透析袋，小心地将胶条周围的溶液转移到灭菌EP管中，然后用少量1×TE冲洗胶条和透析袋内壁，将洗液一并吸入EP管中。 （9） 将透析袋及胶条置于紫外灯下，观察是否收集完全。 （10）用苯酚、苯酚/氯仿和氯仿各抽提收集液一次，加入1/10体积3 M醋酸钠，用2倍体积冰冻的无水乙醇沉淀，70%的乙醇洗2~3次，干燥后溶于适量的TE。 |
2楼2011-04-26 22:07:42
brightfuture01
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【答案】应助回帖
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scelab(金币+5, EPI+1): point-topoint:tiger18: 2011-04-27 08:37:12
scelab(金币+5, EPI+1): point-topoint:tiger18: 2011-04-27 08:37:12
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求助：利用透析袋透析回收BAC文库所需大片段DNA的详细操作流程是怎样的？ 淀粉酶粘贴的是分子克隆手册上的标准protocol。 （1）回收的DNA片段在50kb以上，有什么样品牌什么范围的透析袋？ 截留量不要低于10kDa，我认为选择30-50kDa比较好。 （2）低熔点琼脂糖脉冲电泳，切下所需片段范围的凝胶，放入处理好的透析袋中，留多大的空间？ 将胶块完全浸没就OK了。 用什么溶液透析？ TAE，不要用TBE，TBE对后面的连接反应不利。 需要进行电泳透析吗？ 这个问题很汗。。。。。。。:dnd: 不透析你问这个问题干嘛。。。。。。。 透析多长时间？ 看你的片段大小，片段大的话3个小时也足够了。 透析完毕后，透析袋内的溶液就是自己所要DNA片段吗？ 恩。。。。。 如果溶液较多，也就是回收的DNA浓度太低，如何处理？ 最简单的就是超滤管低速离心浓缩。 |
3楼2011-04-26 22:40:19
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4楼2011-04-26 23:59:30
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【答案】应助回帖
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rainwander(金币+5, EPI+1): 鼓励交流 2011-04-27 19:50:16
rainwander(金币+5, EPI+1): 鼓励交流 2011-04-27 19:50:16
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电泳透析，透析这个词我觉得奇怪，目的是让DNA从胶里跑到透析袋壁上，跟透析有什么关系？ DNA浓度太低不需要用超滤膜，因为DNA会有残留在膜上，一根膜管好几十块，就只能用一次，假如下次还用，上次残留的DNA会污染下一次文库的，所以大概就只能用一次了。还有就是耗时长，速度是随离心转速高而加快的，把20毫升液体浓缩到1毫升可能需要半小时，假如用多根超滤管那就更浪费钱。我首推用乙醇沉淀，一瓶国药500毫升的无水乙醇才大概三四十块人民币，一次沉淀样品最多也就几十毫升。从耗时和耗资两方面来说，我用乙醇。事实上样品的体积不会太大的，建一次文库用的DNA弄一块一百多毫升的琼脂糖电泳胶就够了，电洗脱之后得到的样品最多也就几毫升。 |
5楼2011-04-27 15:25:33
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