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brightfuture01

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5, EPI+1): point-topoint:tiger18: 2011-04-27 08:37:12

求助：利用透析袋透析回收BAC文库所需大片段DNA的详细操作流程是怎样的？

淀粉酶粘贴的是分子克隆手册上的标准protocol。

（1）回收的DNA片段在50kb以上，有什么样品牌什么范围的透析袋？

截留量不要低于10kDa，我认为选择30-50kDa比较好。

（2）低熔点琼脂糖脉冲电泳，切下所需片段范围的凝胶，放入处理好的透析袋中，留多大的空间？

将胶块完全浸没就OK了。

用什么溶液透析？

TAE，不要用TBE，TBE对后面的连接反应不利。

需要进行电泳透析吗？

这个问题很汗。。。。。。。:dnd: 不透析你问这个问题干嘛。。。。。。。

透析多长时间？

看你的片段大小，片段大的话3个小时也足够了。

透析完毕后，透析袋内的溶液就是自己所要DNA片段吗？

恩。。。。。

如果溶液较多，也就是回收的DNA浓度太低，如何处理？

最简单的就是超滤管低速离心浓缩。

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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.

3楼2011-04-26 22:40:19

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
rainwander(金币+5, EPI+1): 鼓励交流 2011-04-27 19:50:16

电泳透析，透析这个词我觉得奇怪，目的是让DNA从胶里跑到透析袋壁上，跟透析有什么关系？

DNA浓度太低不需要用超滤膜，因为DNA会有残留在膜上，一根膜管好几十块，就只能用一次，假如下次还用，上次残留的DNA会污染下一次文库的，所以大概就只能用一次了。还有就是耗时长，速度是随离心转速高而加快的，把20毫升液体浓缩到1毫升可能需要半小时，假如用多根超滤管那就更浪费钱。我首推用乙醇沉淀，一瓶国药500毫升的无水乙醇才大概三四十块人民币，一次沉淀样品最多也就几十毫升。从耗时和耗资两方面来说，我用乙醇。事实上样品的体积不会太大的，建一次文库用的DNA弄一块一百多毫升的琼脂糖电泳胶就够了，电洗脱之后得到的样品最多也就几毫升。

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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。

5楼2011-04-27 15:25:33

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