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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 透析袋 透析回收BAC文库所需大片段DNA的详细操作流程
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feitianrenwo

木虫 (著名写手)

[求助] 透析袋 透析回收BAC文库所需大片段DNA的详细操作流程

求助：利用透析袋透析回收BAC文库所需大片段DNA的详细操作流程是怎样的？
（1）回收的DNA片段在50kb以上，有什么样品牌什么范围的透析袋？
（2）低熔点琼脂糖脉冲电泳，切下所需片段范围的凝胶，放入处理好的透析袋中，留多大的空间？用什么溶液透析？需要进行电泳透析吗？透析多长时间？透析完毕后，透析袋内的溶液就是自己所要DNA片段吗？如果溶液较多，也就是回收的DNA浓度太低，如何处理？
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xiaoyatoua

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1楼 2011-04-26 21:53:40
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5, EPI+1): point-topoint:tiger18: 2011-04-27 08:37:12
求助：利用透析袋透析回收BAC文库所需大片段DNA的详细操作流程是怎样的？

淀粉酶粘贴的是分子克隆手册上的标准protocol。

（1）回收的DNA片段在50kb以上，有什么样品牌什么范围的透析袋？

截留量不要低于10kDa，我认为选择30-50kDa比较好。

（2）低熔点琼脂糖脉冲电泳，切下所需片段范围的凝胶，放入处理好的透析袋中，留多大的空间？

将胶块完全浸没就OK了。

用什么溶液透析？

TAE，不要用TBE，TBE对后面的连接反应不利。

需要进行电泳透析吗？

这个问题很汗。。。。。。。:dnd: 不透析你问这个问题干嘛。。。。。。。

透析多长时间？

看你的片段大小，片段大的话3个小时也足够了。

透析完毕后，透析袋内的溶液就是自己所要DNA片段吗？

恩。。。。。

如果溶液较多，也就是回收的DNA浓度太低，如何处理？

最简单的就是超滤管低速离心浓缩。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-04-26 22:40:19
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★
scelab(金币+3): 谢谢参与 2011-04-27 08:36:12
feitianrenwo(金币+30): 非常感谢 2011-04-27 21:26:50
2.2.2.3 电洗脱法回收DNA片段[176]
（1）透析袋的处理
①将透析袋切成长约10~20 cm的小段。
②将透析袋在含2%（W/V）NaHCO3、1 mM EDTA（pH 8.0）溶液中煮沸10分钟。
③用蒸馏水彻底冲洗透析袋内外壁。
④在1 mM EDTA溶液中（pH 8.0）煮沸10分钟。
⑤自然冷却，透析袋连同 EDTA溶液贮存于4 ℃（贮存期间，应始终让透析袋浸入溶液，以防干燥）。
⑥使用前，用无菌蒸馏水充分冲洗袋的内外壁。
（2）将需回收的DNA进行凝胶电泳，使目标片段与其他大小的片段分离。
（3）凝胶染色后，在紫外灯下用刀片切下含有目的DNA片段的胶条。
（4）将透析袋一端封紧，并将透析袋装满1×TAE，然后将所切胶条放入透析袋中。
（5）倒掉多余的缓冲液（只留100~150 μl左右），夹紧另一端，注意袋内不能留有气泡。
（6） 将含有胶条的透析袋放在1×TAE（或0.5×TBE）电泳槽中，用4~5 V/cm的电压电泳1~2个小时。
（7） 电泳结束前，更换电极，电泳1分钟。
（8） 打开透析袋，小心地将胶条周围的溶液转移到灭菌EP管中，然后用少量1×TE冲洗胶条和透析袋内壁，将洗液一并吸入EP管中。
（9） 将透析袋及胶条置于紫外灯下，观察是否收集完全。
（10）用苯酚、苯酚/氯仿和氯仿各抽提收集液一次，加入1/10体积3 M醋酸钠，用2倍体积冰冻的无水乙醇沉淀，70%的乙醇洗2~3次，干燥后溶于适量的TE。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-04-26 22:07:42
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
本来想做完实验再详细说的，过完离子交换后就不用说了，楼上意见已经差不多了。
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4楼2011-04-26 23:59:30
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
rainwander(金币+5, EPI+1): 鼓励交流 2011-04-27 19:50:16
电泳透析，透析这个词我觉得奇怪，目的是让DNA从胶里跑到透析袋壁上，跟透析有什么关系？

DNA浓度太低不需要用超滤膜，因为DNA会有残留在膜上，一根膜管好几十块，就只能用一次，假如下次还用，上次残留的DNA会污染下一次文库的，所以大概就只能用一次了。还有就是耗时长，速度是随离心转速高而加快的，把20毫升液体浓缩到1毫升可能需要半小时，假如用多根超滤管那就更浪费钱。我首推用乙醇沉淀，一瓶国药500毫升的无水乙醇才大概三四十块人民币，一次沉淀样品最多也就几十毫升。从耗时和耗资两方面来说，我用乙醇。事实上样品的体积不会太大的，建一次文库用的DNA弄一块一百多毫升的琼脂糖电泳胶就够了，电洗脱之后得到的样品最多也就几毫升。
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5楼2011-04-27 15:25:33
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