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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » BAC克隆相关问题请教
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] BAC克隆相关问题请教

1. 找别的课题组拿了一个BAC的质粒DNA，氯霉素抗性，外源片段180kb左右。想转到大肠杆菌中扩繁，但是36小时才有克隆，菌落和质粒PCR均为阴性，一般这种情况正常长出克隆需要多长时间？如何提高转化效率？
Ps： 感受态细胞是商业化的，热激转化和电转化的都试过。

2. 如果在此BAC基础上想酶切后回收30-50kb左右的片段，如果没有脉冲电泳仪，有什么好的方法可以完成。有人建议蔗糖梯度离心，但是没有找到相应的纯化特定大小DNA的方法，纯化蛋白质的倒是有很多。 有哪位赐教相应的详细步骤？

不甚感激！
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1楼 2013-01-15 18:20:14
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dfl204: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢，如你所说，还有一些细节需要再多注意一点。 2013-01-16 12:18:35
个人建议
大肠杆菌一般过夜就能长出克隆，如果你的感受态没有问题的话。
转化效率的影响最大的两个因素就是质粒浓度和感受态。商业化感受态批次不同有时候转化差很多，这得注意。
还有就是质粒的纯度和转化加入的量的问题了，一般1ng的DNA就能饱和50ul的感受态的。
至于大质粒酶切回收小片段，我没成功过。不能瞎说。
能帮到就这么多了……
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2楼2013-01-16 10:58:51
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
dfl204: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2013-01-17 07:49:03
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2013-01-16 10:58:51
个人建议
大肠杆菌一般过夜就能长出克隆，如果你的感受态没有问题的话。
转化效率的影响最大的两个因素就是质粒浓度和感受态。商业化感受态批次不同有时候转化差很多，这得注意。
还有就是质粒的纯度和转化加入的 ...

嗯，其实有时候各方面都注意了，就是出不来东西，慢慢来，希望实验顺利啊。
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3楼2013-01-16 14:39:57
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浅歌99

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dshlove at 2013-01-16 14:39:57
嗯，其实有时候各方面都注意了，就是出不来东西，慢慢来，希望实验顺利啊。...

楼主加油！请问你用的哪一种质粒啊？我最近要开始建BAC文库，正在选择质粒载体，希望能得到一些帮助~
赞一下 回复此楼
4楼2013-07-15 17:12:22
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 浅歌99 at 2013-07-15 18:12:22
楼主加油！请问你用的哪一种质粒啊？我最近要开始建BAC文库，正在选择质粒载体，希望能得到一些帮助~...

pIndigoBAC-5
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5楼2013-07-15 18:41:18
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浅歌99

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dfl204 at 2013-07-15 18:41:18
pIndigoBAC-5...

实验新手，而且实验室之前没人做过，所以可能要向楼主多多讨教，希望您不要厌烦呀，非常感谢
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6楼2013-07-19 15:35:40
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浅歌99

新虫 (初入文坛)
有一个问题想请教你，细胞核包埋块在进行脉冲电泳大片段选择的时候，是一次性选择了吗？还是每几个包埋块选择一次。若是每几个包埋块选择一次的话，是需要不断重复这一步骤的吧？
大概持续多长时间啊？
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7楼2013-08-02 10:41:12
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ccppff123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2013-01-16 10:58:51
个人建议
大肠杆菌一般过夜就能长出克隆，如果你的感受态没有问题的话。
转化效率的影响最大的两个因素就是质粒浓度和感受态。商业化感受态批次不同有时候转化差很多，这得注意。
还有就是质粒的纯度和转化加入的 ...

最近一直在做BAC质粒的酶切再环化试验，请问你用的什么方法进行质粒的提取的，我用OMEGA的低拷贝质粒Kit提取，效果一直不太好。
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8楼2015-04-07 16:21:00
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cry_2013

木虫 (正式写手)
不知道楼主现在还来不来小木虫，我现在在做BAC克隆，刚开始，有点小问题想要问问 楼主，希望能得到楼主的回复，期待中
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9楼2015-05-16 21:02:52
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