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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 克隆的片段连不上T载体怎么回事？？？
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2011jonathan

禁虫 (小有名气)
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1楼 2014-11-02 09:40:05
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vonstar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你的19T应该用了有一段时间吧，我试过里面的酶反复冻融过5次以上，效果特别不好

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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12楼2014-11-03 00:24:39
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圆yy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-11-02 21:59:30
内容已删除
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7楼2014-11-02 21:44:13
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励交流！ 2014-11-02 21:59:21
好歹应该有点自连的啊，楼主这个可能原因就很多了~
第一 有可能是你感受态的问题，感受态找个其他质粒验证一下效率，不好用的话就换吧
第二 楼主你好好看看抗生素有没有用错，不管是种类还是用量，PMD19T的话我记得是氨苄青霉素，100纳克/ml的终浓度吧
第三 你PCR扩增完之后做胶回收或者PCR回收没有？没有的话回收DNA之后再来做连接，同时记得片段/载体摩尔数比是3:1-5：1
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4楼2014-11-02 12:12:58
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DoRbIr

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-04 22:50:29
1、感受态转化完活化了吗？
2、热击时间是不是过长了，我用pMD19-T连接2Kb片段，热击45s就够了。
3、无菌操作的时候有没有离酒精灯太近了，把菌烤死了，我师妹之前做的时候，害怕染菌就出现过这种情况。
你的问题是由于转化或者培养中那个地方没有注意到造成的。
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9楼2014-11-03 00:10:49
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DoRbIr

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还有，在感受态刚刚冻融时效果最好。但感受态细胞十分脆弱，要避免剧烈的操作，不要用枪头反复抽打混匀、涡旋、离心混匀，这样容易造成细胞破裂。只可以用手指轻弹EP管。
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10楼2014-11-03 00:16:44
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普通回帖

SundayMilk

银虫 (初入文坛)
问下楼主用Extaq的理由？

[ 发自小木虫客户端 ]
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急速潜航~
2楼2014-11-02 10:13:40
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2011jonathan

禁虫 (小有名气)
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3楼2014-11-02 11:15:12
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-11-02 22:36:46
我最近也在连，也是遇到同样的问题，连不上，不过我的载体有几次都自连了···
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···
5楼2014-11-02 12:38:55
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2011jonathan

禁虫 (小有名气)
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6楼2014-11-02 14:02:17
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SundayMilk

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
作对照确定问题出在哪。

[ 发自小木虫客户端 ]
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急速潜航~
8楼2014-11-02 23:52:29
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