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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接载体一直连不上
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Young-Tiger

金虫 (小有名气)

[求助] 连接载体一直连不上 已有2人参与

插入片段450bp，要连接的载体有7kb左右，一端平（StuI）一端粘（Bsu36I），浓度设置上，载体：50ng，载体插入片段摩尔比是1：3；连接酶，NEB的5min Quick Ligase 和promega的3h T4都用过了，还是没长出来。昨天一个关键的对照是，我用同样的插入片段同样的酶切位点连一个较小的载体（3kb pGEM）连接成功，所以问题总结后就是，同一个插入片段连小载体成功连大载体失败，请高手指点该怎么改进。
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Enjoymylife
1楼 2014-10-18 00:11:56
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s_lich28

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-19 18:20:39
Young-Tiger: 金币+25, ★有帮助 2014-10-20 20:57:56
楼主的载体最好也要有个positive control，保证闭环的载体转然后可以长出菌落。然后楼主可以试试提高插入片段的比例，片段载体比可以提高到20:1，别担心出现串联插入，双酶切出现串联插入的可能性很小。祝连接成功！
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There is nothing either good or bad, thinking makes it so.
2楼2014-10-18 00:26:53
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Young-Tiger

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by s_lich28 at 2014-10-18 00:26:53
楼主的载体最好也要有个positive control，保证闭环的载体转然后可以长出菌落。然后楼主可以试试提高插入片段的比例，片段载体比可以提高到20:1，别担心出现串联插入，双酶切出现串联插入的可能性很小。祝连接成功！

马上去试，万分感谢
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Enjoymylife
3楼2014-10-18 01:07:03
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593318518

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-10-19 18:20:43
Young-Tiger: 金币+25, ★有帮助 2014-10-20 20:58:05
我觉得可能是载体酶切有问题。可能酶切位点突变
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4楼2014-10-18 10:45:32
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Young-Tiger

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 593318518 at 2014-10-18 10:45:32
我觉得可能是载体酶切有问题。可能酶切位点突变

今天的结果印证了这一点，我按照二楼兄弟的建议，做了positive control  长得满满当当堪比清明上河图，把比例提高到了20：1 还是没有长东西，同时我设置了一个奇葩的对照，把从表达载体上切下来的那段重新连回去，竟然也没长出来，基本印证了酶切位点发生了突变或者星活性切了不该切的地方。
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Enjoymylife
5楼2014-10-18 22:31:54
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