应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接载体一直连不上
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 1243  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Young-Tiger

金虫 (小有名气)

[求助] 连接载体一直连不上 已有2人参与

插入片段450bp，要连接的载体有7kb左右，一端平（StuI）一端粘（Bsu36I），浓度设置上，载体：50ng，载体插入片段摩尔比是1：3；连接酶，NEB的5min Quick Ligase 和promega的3h T4都用过了，还是没长出来。昨天一个关键的对照是，我用同样的插入片段同样的酶切位点连一个较小的载体（3kb pGEM）连接成功，所以问题总结后就是，同一个插入片段连小载体成功连大载体失败，请高手指点该怎么改进。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
Enjoymylife
1楼 2014-10-18 00:11:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

s_lich28

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-19 18:20:39
Young-Tiger: 金币+25, ★有帮助 2014-10-20 20:57:56
楼主的载体最好也要有个positive control，保证闭环的载体转然后可以长出菌落。然后楼主可以试试提高插入片段的比例，片段载体比可以提高到20:1，别担心出现串联插入，双酶切出现串联插入的可能性很小。祝连接成功！
赞一下 回复此楼
There is nothing either good or bad, thinking makes it so.
2楼2014-10-18 00:26:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Young-Tiger

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by s_lich28 at 2014-10-18 00:26:53
楼主的载体最好也要有个positive control，保证闭环的载体转然后可以长出菌落。然后楼主可以试试提高插入片段的比例，片段载体比可以提高到20:1，别担心出现串联插入，双酶切出现串联插入的可能性很小。祝连接成功！

马上去试，万分感谢
赞一下 回复此楼
Enjoymylife
3楼2014-10-18 01:07:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

593318518

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-10-19 18:20:43
Young-Tiger: 金币+25, ★有帮助 2014-10-20 20:58:05
我觉得可能是载体酶切有问题。可能酶切位点突变
赞一下 回复此楼
4楼2014-10-18 10:45:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Young-Tiger

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 593318518 at 2014-10-18 10:45:32
我觉得可能是载体酶切有问题。可能酶切位点突变

今天的结果印证了这一点，我按照二楼兄弟的建议，做了positive control  长得满满当当堪比清明上河图，把比例提高到了20：1 还是没有长东西，同时我设置了一个奇葩的对照，把从表达载体上切下来的那段重新连回去，竟然也没长出来，基本印证了酶切位点发生了突变或者星活性切了不该切的地方。
赞一下 回复此楼
Enjoymylife
5楼2014-10-18 22:31:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Young-Tiger 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿食品科学与工程083200求调剂 +3 XQTJZ 2026-03-30 3/150 2026-03-31 00:02 by jp9609
[考研] 哈尔滨工业大学材料与化工专硕378求调剂 +3 塔比乌斯 2026-03-30 3/150 2026-03-30 22:55 by 无际的草原
[考研] 303求调剂 +7 DLkz1314. 2026-03-30 7/350 2026-03-30 21:07 by peike
[考研] 083000学硕274求调剂 +9 Li李鱼 2026-03-26 9/450 2026-03-30 21:06 by dophin1985
[考研] 材料工程专硕求调剂 +8 hyl3153942 2026-03-29 8/400 2026-03-30 20:45 by dophin1985
[考研] 085600 材料与化工 329分求调剂 +18 Mr. Z 2026-03-25 19/950 2026-03-30 19:01 by Wang200018
[考研] 293求调剂 +3 末未mm 2026-03-30 5/250 2026-03-30 17:23 by 王保杰33
[考研] 328求调剂 +8 嗯滴的基本都 2026-03-27 8/400 2026-03-30 17:20 by Wang200018
[考研] 342求调剂 +4 加油a李zs 2026-03-26 4/200 2026-03-30 16:39 by 晶体之美
[考研] 0703 化学 求调剂，一志愿山东大学 342 分 +7 Shern—- 2026-03-28 7/350 2026-03-30 16:31 by nothing投稿中
[考研] 329求调剂，一志愿西北工业大学，材料工程（085601） +5 小小机灵虫 2026-03-29 11/550 2026-03-30 15:02 by Wang200018
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +4 邱gl 2026-03-26 7/350 2026-03-30 08:39 by 探123
[考研] 【求调剂】085601材料工程专硕 | 总分272 | +7 脚滑的守法公民 2026-03-27 7/350 2026-03-29 20:21 by dophin1985
[考研] 数一英一271专硕（085401）求调剂，可跨 +7 前行必有光 2026-03-28 8/400 2026-03-28 23:22 by 小木虫tim
[考研] 308求调剂 +7 墨墨漠 2026-03-27 7/350 2026-03-28 07:43 by 热情沙漠
[考研] 求调剂推荐 材料 304 +15 荷包蛋hyj 2026-03-26 15/750 2026-03-28 04:13 by fmesaito
[考研] 315分求调剂 +7 26考研上岸版26 2026-03-26 7/350 2026-03-28 04:05 by fmesaito
[考研] 352分 化工与材料 +5 海纳百川Ly 2026-03-27 5/250 2026-03-28 03:39 by fmesaito
[考研] 求调剂 +4 零八# 2026-03-27 4/200 2026-03-27 18:07 by yu221
[考研] 085601 材料工程 313分 求调剂 +5 Ong3 2026-03-27 5/250 2026-03-27 12:24 by goldfish51
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭