应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接载体一直连不上
51/1返回列表
查看: 1217  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Young-Tiger

金虫 (小有名气)

[求助] 连接载体一直连不上 已有2人参与

插入片段450bp，要连接的载体有7kb左右，一端平（StuI）一端粘（Bsu36I），浓度设置上，载体：50ng，载体插入片段摩尔比是1：3；连接酶，NEB的5min Quick Ligase 和promega的3h T4都用过了，还是没长出来。昨天一个关键的对照是，我用同样的插入片段同样的酶切位点连一个较小的载体（3kb pGEM）连接成功，所以问题总结后就是，同一个插入片段连小载体成功连大载体失败，请高手指点该怎么改进。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
Enjoymylife
1楼 2014-10-18 00:11:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

s_lich28

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-19 18:20:39
Young-Tiger: 金币+25, ★有帮助 2014-10-20 20:57:56
楼主的载体最好也要有个positive control，保证闭环的载体转然后可以长出菌落。然后楼主可以试试提高插入片段的比例，片段载体比可以提高到20:1，别担心出现串联插入，双酶切出现串联插入的可能性很小。祝连接成功！
赞一下 回复此楼
There is nothing either good or bad, thinking makes it so.
2楼2014-10-18 00:26:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Young-Tiger

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by s_lich28 at 2014-10-18 00:26:53
楼主的载体最好也要有个positive control，保证闭环的载体转然后可以长出菌落。然后楼主可以试试提高插入片段的比例，片段载体比可以提高到20:1，别担心出现串联插入，双酶切出现串联插入的可能性很小。祝连接成功！

马上去试，万分感谢
赞一下 回复此楼
Enjoymylife
3楼2014-10-18 01:07:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

593318518

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-10-19 18:20:43
Young-Tiger: 金币+25, ★有帮助 2014-10-20 20:58:05
我觉得可能是载体酶切有问题。可能酶切位点突变
赞一下 回复此楼
4楼2014-10-18 10:45:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Young-Tiger

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 593318518 at 2014-10-18 10:45:32
我觉得可能是载体酶切有问题。可能酶切位点突变

今天的结果印证了这一点，我按照二楼兄弟的建议，做了positive control  长得满满当当堪比清明上河图，把比例提高到了20：1 还是没有长东西，同时我设置了一个奇葩的对照，把从表达载体上切下来的那段重新连回去，竟然也没长出来，基本印证了酶切位点发生了突变或者星活性切了不该切的地方。
赞一下 回复此楼
Enjoymylife
5楼2014-10-18 22:31:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Young-Tiger 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085600材料与化工调剂 324分 +6 llllkkkhh 2026-03-18 6/300 2026-03-18 15:32 by cmz0325
[考研] 311求调剂 +6 26研0 2026-03-15 6/300 2026-03-18 14:43 by haxia
[考研] 297求调剂 +8 戏精丹丹丹 2026-03-17 8/400 2026-03-18 14:30 by laoshidan
[考研] 能源材料化学课题组招收硕士研究生8-10名 +4 脱颖而出 2026-03-16 9/450 2026-03-18 14:13 by 脱颖而出
[考研] 【0703化学调剂】-一志愿华中师范大学-六级475 +6 Becho359 2026-03-11 6/300 2026-03-18 12:09 by djl2006
[考研] 0703化学336分求调剂 +6 zbzihdhd 2026-03-15 7/350 2026-03-18 09:53 by zhukairuo
[考研] 材料与化工求调剂 +6 为学666 2026-03-16 6/300 2026-03-17 20:15 by peike
[考研] 085601求调剂 +4 Du.11 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:08 by ruiyingmiao
[考研] 275求调剂 +4 太阳花天天开心 2026-03-16 4/200 2026-03-17 10:53 by 功夫疯狂
[考研] 085601材料工程315分求调剂 +3 yang_0104 2026-03-15 3/150 2026-03-15 10:58 by peike
[考研] 材料工程327求调剂 +3 xiaohe12w 2026-03-11 3/150 2026-03-14 20:20 by ms629
[考研] 本科南京大学一志愿川大药学327 +3 麦田耕者 2026-03-14 3/150 2026-03-14 20:04 by 外星文明
[基金申请] 现在如何回避去年的某一个专家，不知道名字 +3 zk200107 2026-03-12 6/300 2026-03-14 17:13 by zk200107
[基金申请] 有必要更换申报口吗 20+3 fannyamoy 2026-03-11 3/150 2026-03-14 00:52 by zhanghaozhu
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +6 邱gl 2026-03-12 7/350 2026-03-13 23:24 by 邱gl
[考研] 315求调剂 +9 小羊小羊_ 2026-03-11 10/500 2026-03-13 21:13 by SXNU李老师
[考研] 求b区学校调剂 +3 周56 2026-03-11 3/150 2026-03-13 16:20 by JourneyLucky
[考研] 土木第一志愿276求调剂，科研和技能十分丰富，求新兴方向的导师收留 +3 土木小天才 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:01 by JourneyLucky
[论文投稿] 投稿问题 5+4 星光灿烂xt 2026-03-12 6/300 2026-03-13 14:17 by god_tian
[考研] 0817化学工程与技术考研312分调剂 +3 T123 tt 2026-03-12 3/150 2026-03-13 10:49 by houyaoxu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭