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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 转化后做蓝白斑筛选，平板长出蓝白斑后挑取白班PCR鉴定阴性，是什么原因？
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中原揽辔

铜虫 (初入文坛)

[求助] 转化后做蓝白斑筛选，平板长出蓝白斑后挑取白班PCR鉴定阴性，是什么原因？ 已有5人参与

转化后做蓝白斑筛选，平板涂布15小时后长出蓝白斑，挑取白班增菌培养后PCR鉴定全部显示阴性。PCR直接用菌液跑的，请问出现这种状况是因为转化没成功还是PCR有问题？
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1楼 2014-09-09 09:06:50
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yuren2009

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 中原揽辔 at 2014-09-09 14:52:04
筛选数量也不少了，虽然每种菌只做了两管，但是我一共做了7种细菌。我用菌液跑的PCR，但是跑出来的电泳图有拖尾现象，条带最亮的位置在100-200之间，我怀疑是引物二聚体。请问你们跑PCR时菌液一般加多少，细菌蛋白 ...

用牙签蘸在PCR管里抖一下就可以了；摇菌16h左右，吸取1μL加进去PCR就可了。不用考虑细菌蛋白，毕竟样品很少。
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学习使你立于不败之地
7楼2014-09-09 15:44:43
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普通回帖

yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-09 18:10:22
中原揽辔: 金币+1 2014-09-19 09:18:41
白斑中也有阴性的，建议扩大菌落的筛的的数量，活着挑菌后再摇，用菌液PCR验证。
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学习使你立于不败之地
2楼2014-09-09 10:16:16
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qapollo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-09 18:10:31
中原揽辔: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-09-10 12:02:11
不太清楚你用的是什么载体，但是有些载体在酶切后是可以自连的，结果就和插入了目的片段一样表现为白斑。因此蓝白斑不是确定阳性的唯一、准确方法，还需要PCR、测序等等。应对这种情况应该多挑几个克隆，一般来说一个载体挑8~12个就可以了。
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3楼2014-09-09 13:02:17
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中原揽辔

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by qapollo at 2014-09-09 13:02:17
不太清楚你用的是什么载体，但是有些载体在酶切后是可以自连的，结果就和插入了目的片段一样表现为白斑。因此蓝白斑不是确定阳性的唯一、准确方法，还需要PCR、测序等等。应对这种情况应该多挑几个克隆，一般来说一 ...

用的是T载体，我做了好几种细菌每种细菌挑了2管，都没跑出来。请问载体自连的几率很大吗？
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4楼2014-09-09 14:44:47
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中原揽辔

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-09-09 10:16:16
白斑中也有阴性的，建议扩大菌落的筛的的数量，活着挑菌后再摇，用菌液PCR验证。

筛选数量也不少了，虽然每种菌只做了两管，但是我一共做了7种细菌。我用菌液跑的PCR，但是跑出来的电泳图有拖尾现象，条带最亮的位置在100-200之间，我怀疑是引物二聚体。请问你们跑PCR时菌液一般加多少，细菌蛋白质会不会干扰PCR？
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5楼2014-09-09 14:52:04
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qapollo

金虫 (小有名气)
★ ★
中原揽辔(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-10 08:53:06
引用回帖:
4楼: Originally posted by 中原揽辔 at 2014-09-09 14:44:47
用的是T载体，我做了好几种细菌每种细菌挑了2管，都没跑出来。请问载体自连的几率很大吗？...

几年前的时候我用TAKARA-18t载体做Ta克隆，片段在1K到2K，每次连4h，都能连接成功。今年的时候还是用18T载体，片段在1K左右，还是连4h，结果满板的白斑PCR却都是阴性，后来改成连接15min到30min就没问题了。如果你连接用的时间较长就容易自连，而且从我的试验来看4h的时候可能是100%自连。
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6楼2014-09-09 15:21:39
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中原揽辔

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-09-09 15:44:43
用牙签蘸在PCR管里抖一下就可以了；摇菌16h左右，吸取1μL加进去PCR就可了。不用考虑细菌蛋白，毕竟样品很少。...

如果菌液加多了会不会有影响？25μl的体系我加了10倍浓缩的10μl菌液。。。
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8楼2014-09-09 16:30:55
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 中原揽辔 at 2014-09-09 16:30:55
如果菌液加多了会不会有影响？25μl的体系我加了10倍浓缩的10μl菌液。。。...

模板量太大了，反映物质浓度相对降低了，对体系肯定有影响。试着把预变性的温度提高和时间延长试试。
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学习使你立于不败之地
9楼2014-09-09 19:08:34
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刘芬玲

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
中原揽辔(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-10 08:54:05
在摇菌前先做个菌落PCR，用ddH2O做对照，然后再挑选阳性菌落摇菌试试，这样可以缩短实验时间
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10楼2014-09-09 21:46:42
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