应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 转化后做蓝白斑筛选，平板长出蓝白斑后挑取白班PCR鉴定阴性，是什么原因？
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
131/2返回列表12下一页
查看: 4103  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

中原揽辔

铜虫 (初入文坛)

[求助] 转化后做蓝白斑筛选，平板长出蓝白斑后挑取白班PCR鉴定阴性，是什么原因？ 已有5人参与

转化后做蓝白斑筛选，平板涂布15小时后长出蓝白斑，挑取白班增菌培养后PCR鉴定全部显示阴性。PCR直接用菌液跑的，请问出现这种状况是因为转化没成功还是PCR有问题？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-09-09 09:06:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yuren2009

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 中原揽辔 at 2014-09-09 14:52:04
筛选数量也不少了，虽然每种菌只做了两管，但是我一共做了7种细菌。我用菌液跑的PCR，但是跑出来的电泳图有拖尾现象，条带最亮的位置在100-200之间，我怀疑是引物二聚体。请问你们跑PCR时菌液一般加多少，细菌蛋白 ...

用牙签蘸在PCR管里抖一下就可以了；摇菌16h左右，吸取1μL加进去PCR就可了。不用考虑细菌蛋白，毕竟样品很少。
赞一下(1人) 回复此楼
学习使你立于不败之地
7楼2014-09-09 15:44:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-09 18:10:22
中原揽辔: 金币+1 2014-09-19 09:18:41
白斑中也有阴性的，建议扩大菌落的筛的的数量，活着挑菌后再摇，用菌液PCR验证。
赞一下 回复此楼
学习使你立于不败之地
2楼2014-09-09 10:16:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qapollo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-09 18:10:31
中原揽辔: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-09-10 12:02:11
不太清楚你用的是什么载体，但是有些载体在酶切后是可以自连的，结果就和插入了目的片段一样表现为白斑。因此蓝白斑不是确定阳性的唯一、准确方法，还需要PCR、测序等等。应对这种情况应该多挑几个克隆，一般来说一个载体挑8~12个就可以了。
赞一下 回复此楼
3楼2014-09-09 13:02:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

中原揽辔

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by qapollo at 2014-09-09 13:02:17
不太清楚你用的是什么载体，但是有些载体在酶切后是可以自连的，结果就和插入了目的片段一样表现为白斑。因此蓝白斑不是确定阳性的唯一、准确方法，还需要PCR、测序等等。应对这种情况应该多挑几个克隆，一般来说一 ...

用的是T载体，我做了好几种细菌每种细菌挑了2管，都没跑出来。请问载体自连的几率很大吗？
赞一下 回复此楼
4楼2014-09-09 14:44:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

中原揽辔

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-09-09 10:16:16
白斑中也有阴性的，建议扩大菌落的筛的的数量，活着挑菌后再摇，用菌液PCR验证。

筛选数量也不少了，虽然每种菌只做了两管，但是我一共做了7种细菌。我用菌液跑的PCR，但是跑出来的电泳图有拖尾现象，条带最亮的位置在100-200之间，我怀疑是引物二聚体。请问你们跑PCR时菌液一般加多少，细菌蛋白质会不会干扰PCR？
赞一下 回复此楼
5楼2014-09-09 14:52:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qapollo

金虫 (小有名气)
★ ★
中原揽辔(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-10 08:53:06
引用回帖:
4楼: Originally posted by 中原揽辔 at 2014-09-09 14:44:47
用的是T载体，我做了好几种细菌每种细菌挑了2管，都没跑出来。请问载体自连的几率很大吗？...

几年前的时候我用TAKARA-18t载体做Ta克隆，片段在1K到2K，每次连4h，都能连接成功。今年的时候还是用18T载体，片段在1K左右，还是连4h，结果满板的白斑PCR却都是阴性，后来改成连接15min到30min就没问题了。如果你连接用的时间较长就容易自连，而且从我的试验来看4h的时候可能是100%自连。
赞一下 回复此楼
6楼2014-09-09 15:21:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

中原揽辔

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-09-09 15:44:43
用牙签蘸在PCR管里抖一下就可以了；摇菌16h左右，吸取1μL加进去PCR就可了。不用考虑细菌蛋白，毕竟样品很少。...

如果菌液加多了会不会有影响？25μl的体系我加了10倍浓缩的10μl菌液。。。
赞一下 回复此楼
8楼2014-09-09 16:30:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 中原揽辔 at 2014-09-09 16:30:55
如果菌液加多了会不会有影响？25μl的体系我加了10倍浓缩的10μl菌液。。。...

模板量太大了，反映物质浓度相对降低了，对体系肯定有影响。试着把预变性的温度提高和时间延长试试。
赞一下 回复此楼
学习使你立于不败之地
9楼2014-09-09 19:08:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

刘芬玲

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
中原揽辔(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-10 08:54:05
在摇菌前先做个菌落PCR，用ddH2O做对照，然后再挑选阳性菌落摇菌试试，这样可以缩短实验时间
赞一下 回复此楼
10楼2014-09-09 21:46:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 中原揽辔 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 化工学硕 285求调剂 +19 Wisjxn 2026-04-07 19/950 2026-04-07 17:49 by NN.
[考研] 求调剂 +7 月@163.com 2026-04-07 8/400 2026-04-07 17:24 by 蓝云思雨
[考研] 化工求调剂！ +24 RichLi_ 2026-04-06 24/1200 2026-04-07 17:17 by 蓝云思雨
[考研] 化学308分求调剂 +10 你好明天你好 2026-04-07 12/600 2026-04-07 17:08 by rl1980
[考研] 0702物理学学硕299求调剂 +3 祁柒连 2026-04-06 3/150 2026-04-07 12:48 by 小木虫gyh
[考研] 求调剂 一志愿西南交通大学085701环境工程 282分 +13 多多爱吃汉堡 2026-04-04 14/700 2026-04-07 11:22 by 诗与自由
[论文投稿] Decision: Revise for Editor还会送审吗 100+3 CccccccccFD 2026-04-04 5/250 2026-04-07 10:58 by 北京莱茵润色
[考研] 华南理工0703化学，总分336求调剂 +10 手机用户 2026-04-03 11/550 2026-04-06 22:20 by michael2011
[考研] 化学357分，考研调剂 +11 .Starry. 2026-04-04 12/600 2026-04-06 06:28 by houyaoxu
[考研] 301求调剂 +3 XYPLR 2026-04-05 4/200 2026-04-05 19:07 by XYPLR
[考研] 一志愿北京化工大学，初试成绩350求调剂 +9 沿岸?贝壳 2026-04-04 14/700 2026-04-05 01:09 by 沿岸?贝壳
[考研] 342求调剂 +3 Liang7111 2026-04-04 5/250 2026-04-04 19:47 by dongzh2009
[考研] 295求调剂 +3 尚偌呀 2026-04-03 4/200 2026-04-03 21:23 by zhq0425
[考研] 一志愿华中农业071010，总分320求调剂 +7 困困困困坤坤 2026-04-02 7/350 2026-04-03 17:26 by Yuena_Wang
[考研] 283求调剂 +3 jiouuu 2026-04-03 4/200 2026-04-03 13:28 by jiouuu
[考研] 321求调剂 +17 y-yh 2026-04-01 20/1000 2026-04-03 12:57 by y-yh
[考研] 338求调剂，一志愿能源动力，外语是日语203 +5 zzz，，r 2026-04-02 5/250 2026-04-03 09:45 by 蓝云思雨
[考研] 318求调剂，计算材料方向 +10 吸喵有害笙命 2026-04-01 11/550 2026-04-02 16:29 by oooqiao
[考研] 生物学327，求调剂 +5 书上的梅子 2026-04-01 6/300 2026-04-02 06:47 by ilovexiaobin
[考研] 一志愿 南京航空航天大学 ，080500材料科学与工程学硕 +10 @taotao 2026-03-31 11/550 2026-04-01 09:43 by xiayizhi
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭