应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 转化后做蓝白斑筛选，平板长出蓝白斑后挑取白班PCR鉴定阴性，是什么原因？
131/2返回列表12下一页
查看: 4285  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

中原揽辔

铜虫 (初入文坛)

[求助] 转化后做蓝白斑筛选，平板长出蓝白斑后挑取白班PCR鉴定阴性，是什么原因？ 已有5人参与

转化后做蓝白斑筛选，平板涂布15小时后长出蓝白斑，挑取白班增菌培养后PCR鉴定全部显示阴性。PCR直接用菌液跑的，请问出现这种状况是因为转化没成功还是PCR有问题？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-09-09 09:06:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yuren2009

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 中原揽辔 at 2014-09-09 14:52:04
筛选数量也不少了，虽然每种菌只做了两管，但是我一共做了7种细菌。我用菌液跑的PCR，但是跑出来的电泳图有拖尾现象，条带最亮的位置在100-200之间，我怀疑是引物二聚体。请问你们跑PCR时菌液一般加多少，细菌蛋白 ...

用牙签蘸在PCR管里抖一下就可以了；摇菌16h左右，吸取1μL加进去PCR就可了。不用考虑细菌蛋白，毕竟样品很少。
赞一下(1人) 回复此楼
学习使你立于不败之地
7楼2014-09-09 15:44:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-09 18:10:22
中原揽辔: 金币+1 2014-09-19 09:18:41
白斑中也有阴性的，建议扩大菌落的筛的的数量，活着挑菌后再摇，用菌液PCR验证。
赞一下 回复此楼
学习使你立于不败之地
2楼2014-09-09 10:16:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qapollo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-09 18:10:31
中原揽辔: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-09-10 12:02:11
不太清楚你用的是什么载体，但是有些载体在酶切后是可以自连的，结果就和插入了目的片段一样表现为白斑。因此蓝白斑不是确定阳性的唯一、准确方法，还需要PCR、测序等等。应对这种情况应该多挑几个克隆，一般来说一个载体挑8~12个就可以了。
赞一下 回复此楼
3楼2014-09-09 13:02:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

中原揽辔

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by qapollo at 2014-09-09 13:02:17
不太清楚你用的是什么载体，但是有些载体在酶切后是可以自连的，结果就和插入了目的片段一样表现为白斑。因此蓝白斑不是确定阳性的唯一、准确方法，还需要PCR、测序等等。应对这种情况应该多挑几个克隆，一般来说一 ...

用的是T载体，我做了好几种细菌每种细菌挑了2管，都没跑出来。请问载体自连的几率很大吗？
赞一下 回复此楼
4楼2014-09-09 14:44:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

中原揽辔

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-09-09 10:16:16
白斑中也有阴性的，建议扩大菌落的筛的的数量，活着挑菌后再摇，用菌液PCR验证。

筛选数量也不少了，虽然每种菌只做了两管，但是我一共做了7种细菌。我用菌液跑的PCR，但是跑出来的电泳图有拖尾现象，条带最亮的位置在100-200之间，我怀疑是引物二聚体。请问你们跑PCR时菌液一般加多少，细菌蛋白质会不会干扰PCR？
赞一下 回复此楼
5楼2014-09-09 14:52:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qapollo

金虫 (小有名气)
★ ★
中原揽辔(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-10 08:53:06
引用回帖:
4楼: Originally posted by 中原揽辔 at 2014-09-09 14:44:47
用的是T载体，我做了好几种细菌每种细菌挑了2管，都没跑出来。请问载体自连的几率很大吗？...

几年前的时候我用TAKARA-18t载体做Ta克隆，片段在1K到2K，每次连4h，都能连接成功。今年的时候还是用18T载体，片段在1K左右，还是连4h，结果满板的白斑PCR却都是阴性，后来改成连接15min到30min就没问题了。如果你连接用的时间较长就容易自连，而且从我的试验来看4h的时候可能是100%自连。
赞一下 回复此楼
6楼2014-09-09 15:21:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

中原揽辔

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-09-09 15:44:43
用牙签蘸在PCR管里抖一下就可以了；摇菌16h左右，吸取1μL加进去PCR就可了。不用考虑细菌蛋白，毕竟样品很少。...

如果菌液加多了会不会有影响？25μl的体系我加了10倍浓缩的10μl菌液。。。
赞一下 回复此楼
8楼2014-09-09 16:30:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 中原揽辔 at 2014-09-09 16:30:55
如果菌液加多了会不会有影响？25μl的体系我加了10倍浓缩的10μl菌液。。。...

模板量太大了，反映物质浓度相对降低了，对体系肯定有影响。试着把预变性的温度提高和时间延长试试。
赞一下 回复此楼
学习使你立于不败之地
9楼2014-09-09 19:08:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

刘芬玲

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
中原揽辔(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-10 08:54:05
在摇菌前先做个菌落PCR，用ddH2O做对照，然后再挑选阳性菌落摇菌试试，这样可以缩短实验时间
赞一下 回复此楼
10楼2014-09-09 21:46:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 中原揽辔 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 10/500 2026-08-23 07:17 by OEbVnUOu01ol
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 5/250 2026-08-23 04:07 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:43 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 6/300 2026-08-23 03:40 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 11/550 2026-08-23 02:55 by OEbVnUOu01ol
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 3/150 2026-08-23 00:55 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +3 zjuhero 2026-08-22 4/200 2026-08-22 20:02 by mycsru
[基金申请] 什么时候开奖？ +7 CrisMessi 2026-08-18 8/400 2026-08-22 18:29 by 淀粉搬运工
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 4/200 2026-08-22 16:52 by sunzitan
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭