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中原揽辔

铜虫 (初入文坛)

[求助] 转化后做蓝白斑筛选,平板长出蓝白斑后挑取白班PCR鉴定阴性,是什么原因? 已有5人参与

转化后做蓝白斑筛选,平板涂布15小时后长出蓝白斑,挑取白班增菌培养后PCR鉴定全部显示阴性。PCR直接用菌液跑的,请问出现这种状况是因为转化没成功还是PCR有问题?
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yuren2009

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 中原揽辔 at 2014-09-09 14:52:04
筛选数量也不少了,虽然每种菌只做了两管,但是我一共做了7种细菌。我用菌液跑的PCR,但是跑出来的电泳图有拖尾现象,条带最亮的位置在100-200之间,我怀疑是引物二聚体。请问你们跑PCR时菌液一般加多少,细菌蛋白 ...

用牙签蘸在PCR管里抖一下就可以了;摇菌16h左右,吸取1μL加进去PCR就可了。不用考虑细菌蛋白,毕竟样品很少。
学习使你立于不败之地
7楼2014-09-09 15:44:43
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普通回帖

yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-09-09 18:10:22
中原揽辔: 金币+1 2014-09-19 09:18:41
白斑中也有阴性的,建议扩大菌落的筛的的数量,活着挑菌后再摇,用菌液PCR验证。
学习使你立于不败之地
2楼2014-09-09 10:16:16
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qapollo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-09-09 18:10:31
中原揽辔: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-09-10 12:02:11
不太清楚你用的是什么载体,但是有些载体在酶切后是可以自连的,结果就和插入了目的片段一样表现为白斑。因此蓝白斑不是确定阳性的唯一、准确方法,还需要PCR、测序等等。应对这种情况应该多挑几个克隆,一般来说一个载体挑8~12个就可以了。
3楼2014-09-09 13:02:17
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中原揽辔

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by qapollo at 2014-09-09 13:02:17
不太清楚你用的是什么载体,但是有些载体在酶切后是可以自连的,结果就和插入了目的片段一样表现为白斑。因此蓝白斑不是确定阳性的唯一、准确方法,还需要PCR、测序等等。应对这种情况应该多挑几个克隆,一般来说一 ...

用的是T载体,我做了好几种细菌每种细菌挑了2管,都没跑出来。请问载体自连的几率很大吗?
4楼2014-09-09 14:44:47
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中原揽辔

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-09-09 10:16:16
白斑中也有阴性的,建议扩大菌落的筛的的数量,活着挑菌后再摇,用菌液PCR验证。

筛选数量也不少了,虽然每种菌只做了两管,但是我一共做了7种细菌。我用菌液跑的PCR,但是跑出来的电泳图有拖尾现象,条带最亮的位置在100-200之间,我怀疑是引物二聚体。请问你们跑PCR时菌液一般加多少,细菌蛋白质会不会干扰PCR?
5楼2014-09-09 14:52:04
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qapollo

金虫 (小有名气)

★ ★
中原揽辔(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-10 08:53:06
引用回帖:
4楼: Originally posted by 中原揽辔 at 2014-09-09 14:44:47
用的是T载体,我做了好几种细菌每种细菌挑了2管,都没跑出来。请问载体自连的几率很大吗?...

几年前的时候我用TAKARA-18t载体做Ta克隆,片段在1K到2K,每次连4h,都能连接成功。今年的时候还是用18T载体,片段在1K左右,还是连4h,结果满板的白斑PCR却都是阴性,后来改成连接15min到30min就没问题了。如果你连接用的时间较长就容易自连,而且从我的试验来看4h的时候可能是100%自连。
6楼2014-09-09 15:21:39
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中原揽辔

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-09-09 15:44:43
用牙签蘸在PCR管里抖一下就可以了;摇菌16h左右,吸取1μL加进去PCR就可了。不用考虑细菌蛋白,毕竟样品很少。...

如果菌液加多了会不会有影响?25μl的体系我加了10倍浓缩的10μl菌液。。。
8楼2014-09-09 16:30:55
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 中原揽辔 at 2014-09-09 16:30:55
如果菌液加多了会不会有影响?25μl的体系我加了10倍浓缩的10μl菌液。。。...

模板量太大了,反映物质浓度相对降低了,对体系肯定有影响。试着把预变性的温度提高和时间延长试试。
学习使你立于不败之地
9楼2014-09-09 19:08:34
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刘芬玲

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
中原揽辔(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-10 08:54:05
在摇菌前先做个菌落PCR,用ddH2O做对照,然后再挑选阳性菌落摇菌试试,这样可以缩短实验时间
10楼2014-09-09 21:46:42
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