【答案】应助回帖

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 猜你喜欢

为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种? 已经有5人回复
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》已经有3人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有53人回复
求助食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社电子版已经有5人回复
胶体几丁质的结晶度？已经有0人回复
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士已经有2人回复
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线已经有5人回复

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

急急急，基因组PCR扩增，结果无目的条带，求助！！！已经有4人回复
电泳的时候，总DNA跑出条带，PCR扩增后没有条带，都有什么原因啊已经有8人回复
求PCR条件优化已经有8人回复
半年了，16S rDNA V3区PCR产物弥散，疑似比目的条带大一些些的杂带？已经有7人回复
诚心求教各位前辈：筛选扩增体系时的PCR图片，这是怎么回事啊？已经有5人回复
PCR产物弥散扩不出来怎么回事啊求教谢谢已经有5人回复
PCR大侠们,我的PCR结果怎么会这样：条带很宽，有些还弥散已经有18人回复
PCR扩增DNA序列无条带已经有46人回复
PCR结果出现弥散现象已经有21人回复
3个片段的重叠延伸pcr,pcr反应条件？已经有7人回复
PCR产物再次PCR无条带只有弥散已经有18人回复
PCR反应体系中各种成分的作用-搜集版已经有490人回复
tail pcr 第一轮老是弥散。。。已经有8人回复
这样的电泳图片是否代表PCR扩增成功了？已经有26人回复
做pcr时pcr管子变形严重是怎么回事？已经有21人回复
大片段PCR扩增求助已经有34人回复
overlap PCR做不出来呐。。。。已经有23人回复
二次PCR产物弥散已经有12人回复
3‘RACE inner PCR 电泳结果总是有弥散现象回收条带不成带状什么原因啊？已经有17人回复
采用巢式PCR扩增已经有4人回复
【求助/交流】PCR产物电泳条带弥散？？？已经有30人回复
【求助/交流】样品PCR老是涂抹带是怎么回事已经有10人回复
【求助/交流】PCR 的原理是啥啊已经有20人回复

1楼2014-08-17 21:43:51

owl2010

金虫 (正式写手)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 2619.7
散金: 608
红花: 24
帖子: 433
在线: 699.8小时
虫号: 1338696
注册: 2011-07-06
性别: GG
专业: 林木遗传育种学

是不是模板有降解，电泳看一下模板有没有问题。

男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。

2楼2014-08-18 12:13:27

vapordw

新虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 4.3
帖子: 13
在线: 6.2小时
虫号: 3222820
注册: 2014-05-21

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lilongping(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-18 15:50:31

既然条件跟试剂都一样，差不多也就是模板有问题了吧

3楼2014-08-18 14:38:55

trizol11

木虫 (正式写手)

应助: 47 (小学生)
金币: 2714.2
散金: 199
红花: 3
帖子: 572
在线: 172.8小时
虫号: 1711824
注册: 2012-03-23
性别: GG
专业: 兽医药理学与毒理学

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lilongping(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-18 15:50:39

酶量太大，延伸时间短，你修改一下在跑一次试试，
拖带很严重。

任重道远……

4楼2014-08-18 15:21:05

lilongping

新虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 5960.1
散金: 20
帖子: 613
在线: 64.6小时
虫号: 884477
注册: 2009-10-26
性别: GG
专业: 畜牧学

引用回帖:

2楼: Originally posted by owl2010 at 2014-08-18 12:13:27
是不是模板有降解，电泳看一下模板有没有问题。

新提取的基因组DNA用同样的方法做出来也是这样，严重拖尾啊，我现在都不知道该怎么办呢？

5楼2014-08-18 22:34:49

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

专家经验: +218
MolEPI: 44
应助: 397 (硕士)
贵宾: 0.044
金币: 2118.9
散金: 10
红花: 208
帖子: 5633
在线: 571.6小时
虫号: 1766465
注册: 2012-04-19
性别: MM
专业: 生物大分子结构与功能
管辖: 生物科学综合

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策

凌波丽

2013年8月23日总结（第二次修订，加上序号，使文章的层次清晰，另外修正了错漏之处）
2013年10月9日凌晨第三次修改补充。

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差或酶的专一性不够，DNA模板量过大，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，模板长于3kb所引起。

其对策有：
  1.减少酶量（一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点，分梯度上下调一调，其他酶也差不多如此浓度，可以参考说明书）；加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。
  2. 增加DNA聚合酶的专一性。
（1）改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。
（2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起酶的浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。
（3）为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。的专一性，可在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。
3.适当减少dNTP的浓度；减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓度同方向偶联进行，但是不必按同样的比例。
4.适当降低Mg2+浓度，可以采用梯度递减方式，以每次0.5mol/L递减，但是Mg2+的终浓度不要低于1.0mol/L。
5. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。
6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
7.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。
8. 保证PCR反应的DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。
9.以上措施都不行时，最后就只能重新设计引物，加强引物的专一性。
10.适当减少DNA模板量。
11.适当减少循环次数，一般也就循环25次就差不多了。
12.如果楼主的PCR模板是3kb或者更大，用普通PCR效果大概不会很理想，应该考虑使用Long-Range PCR。

楼主三次的实验流程和试剂一样，但这次效果如此不好，我个人认为：首先考虑酶的质量、模板质量（放久了模板也可能发生降解，尤其是反复冻融）、其他的试剂的质量，实际操作是不是失准等问题（可能一些操作细节由于以前的成功，所以这次比较放松了，实际的操作并不标准）等。

赞一下(5人)

6楼2014-08-19 02:14:17