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PCR产物弥散 扩不出来 怎么回事啊 求教 谢谢
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lily0423
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PCR产物弥散 扩不出来 怎么回事啊 求教 谢谢
这是提取的土壤DNA进行PCR,是氨氧化细菌的功能基因 扩增出来为什么是一片白?右侧4个隐约可以看到目的基因 但是很淡!我的是 退火57度 30s,延伸 72度45秒
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2013-09-10 20:00:05
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2013-09-12 09:57:46
1.在引物没有试验过,PCR条件没确定的情况下,建议用梯度PCR仪确定退火温度。
2.有阳性模板的情况下设立阳性对照。(成功的pCR结果,稀释1000倍就可以)建议每次都设立。
3.模板的问题。(和样品有关,有一定的可能)
4.引物设计和模板不匹配。因为引物可能是简并引物,特异性较差。或分离的菌株同标准菌株的序列有所差异。
5.极端的解决办法是胶回收PCR产物条带。以其为模板再扩增。然后测序。(实在没办法时,可以尝试)
或在PCR目的片段内再设计一段截短的片段,以PCR结果为模板做二次PCR
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2013-09-11 08:29:30
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at 2013-09-11 08:29:30
1.在引物没有试验过,PCR条件没确定的情况下,建议用梯度PCR仪确定退火温度。
2.有阳性模板的情况下设立阳性对照。(成功的pCR结果,稀释1000倍就可以)建议每次都设立。
3.模板的问题。(和样品有关,有一定的可 ...
恩谢谢您的耐心。我想知道为什么点样品的那些孔用到都是白色的?是非特异扩增还是什么?
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3楼
2013-09-11 08:58:29
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应该是非特异。不过特异性太差了,根本分不清条带。。。先跑个退火的梯度吧。要不就做降落PCR试试。PCR条件优化有时很费时间的。退火温度有时差1度,天壤之别呀。还有下次这种图可以用反转片看,白背景黑条带更清晰些。
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2013-09-12 09:01:55
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应该是非特异。不过特异性太差了,根本分不清条带。。。先跑个退火的梯度吧。要不就做降落PCR试试。PCR条件优化有时很费时间的。退火温度有时差1度,天壤之别呀。还有下次这种图可以用反转片看,白背景黑条带更清晰 ...
我这是dgge割胶下来的条带,溶于水,用不带夹子的引物扩增的,好像没有扩增出来。后面要克隆测序的,哎,p了好多次都不行
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2013-09-12 12:27:23
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lily0423
at 2013-09-12 12:27:23
我这是dgge割胶下来的条带,溶于水,用不带夹子的引物扩增的,好像没有扩增出来。后面要克隆测序的,哎,p了好多次都不行
...
试试降落pcr,退火62度10个循环,55度25到30个循环试试。PCR条件不定时就是这样的,我们曾经遇到过挪了一次PCR仪,结果就不出了,移回原位就又出了,结果证明PCR仪的散热情况影响PCR反应。继续吧。
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6楼
2013-09-12 13:31:43
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