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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物弥散 扩不出来 怎么回事啊 求教 谢谢
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lily0423

银虫 (小有名气)

[求助] PCR产物弥散 扩不出来 怎么回事啊 求教 谢谢

这是提取的土壤DNA进行PCR，是氨氧化细菌的功能基因 扩增出来为什么是一片白？右侧4个隐约可以看到目的基因 但是很淡！我的是 退火57度 30s，延伸 72度45秒
PCR产物弥散 扩不出来 怎么回事啊 求教 谢谢
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1楼 2013-09-10 20:00:05
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lily0423

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-12 09:01:55
应该是非特异。不过特异性太差了，根本分不清条带。。。先跑个退火的梯度吧。要不就做降落PCR试试。PCR条件优化有时很费时间的。退火温度有时差1度，天壤之别呀。还有下次这种图可以用反转片看，白背景黑条带更清晰 ...

我这是dgge割胶下来的条带，溶于水，用不带夹子的引物扩增的，好像没有扩增出来。后面要克隆测序的，哎，p了好多次都不行

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2013-09-12 12:27:23
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-12 09:57:46
1.在引物没有试验过，PCR条件没确定的情况下，建议用梯度PCR仪确定退火温度。
2.有阳性模板的情况下设立阳性对照。（成功的pCR结果，稀释1000倍就可以）建议每次都设立。
3.模板的问题。（和样品有关，有一定的可能）
4.引物设计和模板不匹配。因为引物可能是简并引物，特异性较差。或分离的菌株同标准菌株的序列有所差异。
5.极端的解决办法是胶回收PCR产物条带。以其为模板再扩增。然后测序。（实在没办法时，可以尝试）
  或在PCR目的片段内再设计一段截短的片段，以PCR结果为模板做二次PCR
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2楼2013-09-11 08:29:30
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lily0423

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-11 08:29:30
1.在引物没有试验过，PCR条件没确定的情况下，建议用梯度PCR仪确定退火温度。
2.有阳性模板的情况下设立阳性对照。（成功的pCR结果，稀释1000倍就可以）建议每次都设立。
3.模板的问题。（和样品有关，有一定的可 ...

恩谢谢您的耐心。我想知道为什么点样品的那些孔用到都是白色的？是非特异扩增还是什么？
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3楼2013-09-11 08:58:29
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-12 09:57:54
应该是非特异。不过特异性太差了，根本分不清条带。。。先跑个退火的梯度吧。要不就做降落PCR试试。PCR条件优化有时很费时间的。退火温度有时差1度，天壤之别呀。还有下次这种图可以用反转片看，白背景黑条带更清晰些。
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4楼2013-09-12 09:01:55
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