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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 采用巢式PCR扩增
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)

[求助] 采用巢式PCR扩增

最近一直用巢式PCR扩增目的片段，P了好久就不出来，想听听各位虫虫的建议
外侧引物的TM值分别为63.3、67.1
内侧引物的TM值分别为51.2、53.0（不算酶切位点的TM值）
                     71.2、72.2（包括酶切位点的TM值）
用什么条件P会好些？
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1楼 2011-05-30 10:51:00
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deblway

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-05-30 12:45:54
睡着数绵羊(金币+2): 说的很详细，非常感谢！ 2011-05-30 15:35:09
具体条件我想应该需要做梯度才能确定呢。。以前我也碰到过类似问题，我的解决办法是外侧引物首先用较低的温度去P，不去管它的非特异性有多强，只要控制循环数过少的引入PCR过程中带来的突变即可。。。然后利用外侧PCR产物直接做模板来做内侧PCR，我是做一个梯度，寻找最合适的温度来做！一般来说内侧引物与你外侧产物的特异性结合应该会较强些。。基本上出结果都和特异性的出现目的条带。。。。如果还是不出结果的话。。当然在排除了引物的前提下，模板量是不是很低呢？是RNA样品？还是分离的mRNA反转出的cDNA,总之，如果做了好多次了还不出的话，我认为PCR本身程序和流程问题不大，引物和模板才是关键，引物一般来说也不会出现问题，但还是建议核对一遍。。。模板吗确定的方法很多。。如果RNA反转录的cDNA也是需要确定RNA质量的。。如果mRNA量较低的话还是没法克隆出目的片段滴！当然前提下是确实在提取的RNA中有mRNA的表达！有些组织或细胞一种mRNA表达量是很低的，需要刺激才能产生。。或者干脆提mRNA增大模板的量。。以前做过一段片段，一直没办P出来，文献报道也是这个组织当中，最后我直接提该组织的癌细胞系（毕竟癌细胞好多蛋白都大量表达，部分mRNA水平也较高），幸运的是获得的没有任何突变。。。说的挺乱的，不知道能不能帮到你捏！
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海贼王！哥当定了。。。。
2楼2011-05-30 11:07:48
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by deblway at 2011-05-30 11:07:48:
具体条件我想应该需要做梯度才能确定呢。。以前我也碰到过类似问题，我的解决办法是外侧引物首先用较低的温度去P，不去管它的非特异性有多强，只要控制循环数过少的引入PCR过程中带来的突变即可。。。然后利用外侧 ...

模板是基因组，用试剂盒提的有600多ng/μL，温度梯度多了很多可就是看不到条带。
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3楼2011-05-30 15:36:22
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by deblway at 2011-05-30 11:07:48
具体条件我想应该需要做梯度才能确定呢。。以前我也碰到过类似问题，我的解决办法是外侧引物首先用较低的温度去P，不去管它的非特异性有多强，只要控制循环数过少的引入PCR过程中带来的突变即可。。。然后利用外侧P ...

您好，我做巢式PCR做了一周多了，用特异性引物和此模板可以扩增出来，第一轮一直没有东西，第二轮也没有东西。退火温度和模板梯度都做了，但是还是不行。可能原因有哪些呢？
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4楼2013-05-16 22:10:50
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elapse1113

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ljx2ljx at 2013-05-16 22:10:50
您好，我做巢式PCR做了一周多了，用特异性引物和此模板可以扩增出来，第一轮一直没有东西，第二轮也没有东西。退火温度和模板梯度都做了，但是还是不行。可能原因有哪些呢？...

你后来做出来了吗？怎么出的条带？
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5楼2015-07-09 19:32:14
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