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deblway

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-05-30 12:45:54
睡着数绵羊(金币+2): 说的很详细,非常感谢! 2011-05-30 15:35:09
具体条件我想应该需要做梯度才能确定呢。。以前我也碰到过类似问题,我的解决办法是外侧引物首先用较低的温度去P,不去管它的非特异性有多强,只要控制循环数过少的引入PCR过程中带来的突变即可。。。然后利用外侧PCR产物直接做模板来做内侧PCR,我是做一个梯度,寻找最合适的温度来做!一般来说内侧引物与你外侧产物的特异性结合应该会较强些。。基本上出结果都和特异性的出现目的条带。。。。如果还是不出结果的话。。当然在排除了引物的前提下,模板量是不是很低呢?是RNA样品?还是分离的mRNA反转出的cDNA,总之,如果做了好多次了还不出的话,我认为PCR本身程序和流程问题不大,引物和模板才是关键,引物一般来说也不会出现问题,但还是建议核对一遍。。。模板吗确定的方法很多。。如果RNA反转录的cDNA也是需要确定RNA质量的。。如果mRNA量较低的话还是没法克隆出目的片段滴!当然前提下是确实在提取的RNA中有mRNA的表达!有些组织或细胞一种mRNA表达量是很低的,需要刺激才能产生。。或者干脆提mRNA增大模板的量。。以前做过一段片段,一直没办P出来,文献报道也是这个组织当中,最后我直接提该组织的癌细胞系(毕竟癌细胞好多蛋白都大量表达,部分mRNA水平也较高),幸运的是获得的没有任何突变。。。说的挺乱的,不知道能不能帮到你捏!
海贼王!哥当定了。。。。
2楼2011-05-30 11:07:48
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