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lilongping新虫 (正式写手)
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[求助]
PCR扩增严重弥散，但是以前用同样方法，条件和试剂都是结果非常好的 已有5人参与
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大家看看我这个PCR图片是什么原因呢？ PCR条件是：94° 60s， 52°60s，72° 5min， 扩增循环35圈，用的是3步PCR实验的。这个程序我一直在用，模板是细菌基因组。前一段时间用同样的PCR方法，试剂，模板等等都是一样的，扩增出来了目的条带，实验结果非常好。最近，我想重复这个实验，再做一些回收回来测序用，但是，怎么重复，都是这种严重弥散啊，大家看看这种情况应该怎么办呢？ 前后用的PCR条件和试剂都是完全一样的。 两边最边上的3个泳道都是不同大小的DNA分子量标准Marker，他们是清醒可见的。  2014-08-14 5个12_5扩增失败.jpg |
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 核酸生物学实验经验 |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策 凌波丽 2013年8月23日总结（第二次修订，加上序号，使文章的层次清晰，另外修正了错漏之处） 2013年10月9日凌晨第三次修改补充。 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差或酶的专一性不够，DNA模板量过大，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，模板长于3kb所引起。 其对策有： 1.减少酶量（一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点，分梯度上下调一调，其他酶也差不多如此浓度，可以参考说明书）；加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。 2. 增加DNA聚合酶的专一性。 （1）改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。 （2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起酶的浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。 （3）为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。 的专一性，可在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。 3.适当减少dNTP的浓度；减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓度同方向偶联进行，但是不必按同样的比例。 4.适当降低Mg2+浓 度，可以采用梯度递减方式，以每次0.5mol/L递减，但是Mg2+的终浓度不要低于1.0mol/L。 5. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。 6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。 7.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。 8. 保证PCR反应的DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。 9.以上措施都不行时，最后就只能重新设计引物，加强引物的专一性。 10.适当减少DNA模板量。 11.适当减少循环次数，一般也就循环25次就差不多了。 12.如果楼主的PCR模板是3kb或者更大，用普通PCR效果大概不会很理想，应该考虑使用Long-Range PCR。 楼主三次的实验流程和试剂一样，但这次效果如此不好，我个人认为：首先考虑酶的质量、模板质量（放久了模板也可能发生降解，尤其是反复冻融）、其他的试剂的质量，实际操作是不是失准等问题（可能一些操作细节由于以前的成功，所以这次比较放松了，实际的操作并不标准）等。 |
6楼2014-08-19 02:14:17
owl2010
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4楼2014-08-18 15:21:05
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