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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » T载体连接问题
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qauzgd

铁虫 (初入文坛)

[求助] T载体连接问题 已有2人参与

大家好，我的目的片段1600多点，PCR出来后要做测序然后农杆菌转化植株的。
PCR的产物长度正常，连PMD-18T载体，转DH5α，蓝白斑（有蓝白斑但是很稀）。
然后就出问题了，摇起来的菌液用上述的引物PCR，要么没东西要么2000+的产物，2000+的菌液去生工测序，回了俩片段都是载体序列。

求问是哪里出问题啊，连T载体做了快一个月了，一直这样。。实在不行我就拿PCR产物去生工测了。。。谢谢大家！

补上句，其他人用同样地酶和载体.菌，连T载体，一次就连上了。。。
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1楼 2014-08-17 17:17:17
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qauzgd: 金币+3 2014-09-13 19:44:44
1.末端要加A
2.你的载体与片段的比例要计算好
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5楼2014-08-18 15:23:24
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owl2010

金虫 (正式写手)
★ ★
qauzgd(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:34:37
目测T载体自连，T载体2000多bp，片段1600，算是大片段了，几百bp连T很容易连进去的，应该好好按摩尔比算一下。 另外你可以用M13引物去P一下2000多的菌液，顺便做个水对照看一下。
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男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
2楼2014-08-17 18:39:26
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR产物纯化后有没有加A尾巴？没有加的话很难连接上去的……
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
3楼2014-08-17 19:05:20
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考拉003

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangranjun at 2014-08-17 19:05:20
PCR产物纯化后有没有加A尾巴？没有加的话很难连接上去的……

一般rtaqPCR都会自动加A的。这位仁兄的问题就是载体自连了吧。。。。。换个载体试试，我们用的pGEM--T载体，还好
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不是微生物专业的却进入微生物行业
4楼2014-08-17 19:41:06
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