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qauzgd

铁虫 (初入文坛)

[求助] T载体连接问题 已有2人参与

大家好,我的目的片段1600多点,PCR出来后要做测序然后农杆菌转化植株的。
PCR的产物长度正常,连PMD-18T载体,转DH5α,蓝白斑(有蓝白斑但是很稀)。
然后就出问题了,摇起来的菌液用上述的引物PCR,要么没东西要么2000+的产物,2000+的菌液去生工测序,回了俩片段都是载体序列。

求问是哪里出问题啊,连T载体做了快一个月了,一直这样。。实在不行我就拿PCR产物去生工测了。。。谢谢大家!

补上句,其他人用同样地酶和载体.菌,连T载体,一次就连上了。。。
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考拉003

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wangranjun at 2014-08-17 19:05:20
PCR产物纯化后有没有加A尾巴?没有加的话很难连接上去的……

一般rtaqPCR都会自动加A的。这位仁兄的问题就是载体自连了吧。。。。。换个载体试试,我们用的pGEM--T载体,还好
不是微生物专业的却进入微生物行业
4楼2014-08-17 19:41:06
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查看全部 5 个回答

owl2010

金虫 (正式写手)

★ ★
qauzgd(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-17 20:34:37
目测T载体自连,T载体2000多bp,片段1600,算是大片段了,几百bp连T很容易连进去的,应该好好按摩尔比算一下。 另外你可以用M13引物去P一下2000多的菌液,顺便做个水对照看一下。
男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
2楼2014-08-17 18:39:26
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR产物纯化后有没有加A尾巴?没有加的话很难连接上去的……
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
3楼2014-08-17 19:05:20
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
qauzgd: 金币+3 2014-09-13 19:44:44
1.末端要加A
2.你的载体与片段的比例要计算好
5楼2014-08-18 15:23:24
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