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flll2014

铜虫 (小有名气)

[交流] 纯化蛋白质问题 已有4人参与

我的蛋白质等电点大约是5.6，做纯化蛋白质时用的裂解液为PH 8.0的tris缓冲液，300ml菌液加入了10ml的裂解液，超声破碎30min.然后直接过滤进行镍柱纯化，过镍柱时用的是咪唑梯度为25，50，100，150，250的tris缓冲液,pH=8.0。
图一是进行的蛋白质可溶性分析，上清中含量较高。为什么一经过镍柱蛋白几乎就没有了呢？图2为过镍柱的图

纯化蛋白质问题
蛋白质可溶性分析图片1.png


纯化蛋白质问题-1
纯化蛋白图片2.png
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1楼 2014-08-13 11:12:42
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2026533696

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
流传了，没挂上柱子
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2楼2014-08-13 20:07:39
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weebug

版主 (著名写手)
是什么蛋白呢？
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天蓝蓝兮日头晒
3楼2014-08-14 11:18:57
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flll2014

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by weebug at 2014-08-14 11:18:57
是什么蛋白呢？

可溶性的蛋白质
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4楼2014-08-14 21:16:10
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weebug

版主 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
会不会是缓冲液的关系，都洗脱了。
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天蓝蓝兮日头晒
5楼2014-08-15 11:44:37
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flyingsky305

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
超声波时间好像太长了。我一般500ml菌，10s on, 10s off, 有效处理时间1.5-2min，30％功率。
超声后，取40ul用于测可溶性，再上柱。如果蛋白可溶，但仍然不挂柱，可能是纯化标签被包埋到蛋白里面了，可将标签换到蛋白另外一端试试。

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6楼2014-08-15 14:37:00
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flll2014

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by weebug at 2014-08-15 11:44:37
会不会是缓冲液的关系，都洗脱了。

嗯，不太清楚呢，是每个浓度都有目的蛋白呢，要是这些合起来的话应该还浓些，如果是缓冲液的问题一般怎么处理呢
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7楼2014-08-15 19:50:27
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weebug

版主 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换另一种缓冲液。得做些功课，看哪一种适合。
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天蓝蓝兮日头晒
8楼2014-08-16 10:22:19
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flll2014

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by weebug at 2014-08-16 10:22:19
换另一种缓冲液。得做些功课，看哪一种适合。

谢谢啊，我换了缓冲液，并且咪唑梯度减少了，发现纯化浓度高了不少
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9楼2014-08-16 15:09:17
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flll2014

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by flyingsky305 at 2014-08-15 14:37:00
超声波时间好像太长了。我一般500ml菌，10s on, 10s off, 有效处理时间1.5-2min，30％功率。
超声后，取40ul用于测可溶性，再上柱。如果蛋白可溶，但仍然不挂柱，可能是纯化标签被包埋到蛋白里面了，可将标签换到蛋 ...

这个处理 时间会不会太短了啊，你的500ml菌加多少裂解液你，还有请问下那个纯化柱子用的是哪个公司的，谢谢
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10楼2014-08-16 15:11:41
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