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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 想检测一个大约4kD 的小肽片段，western blot 一直没有条带怎么办
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wangxueflower

木虫 (小有名气)

[交流] 想检测一个大约4kD 的小肽片段，western blot 一直没有条带怎么办 已有6人参与

最近一直在做一个4kD小肽片段的western, 试过一般的SDS-Page,也尝试过tricine-SDS-page, 但是一直检测不到条带，
很是郁闷啊，这个小肽是一个前体蛋白经过酶切后的产物。我用的抗体也是一般常用的特异性抗体。上样量是30ug/孔。
是不是上样量太少的原因啊? 还有是不是因为这个小肽的产量不高？ 转膜方面， 我用的是100V 冰上转膜一个半小时，是不是转过了？

请虫友们给点建议吧
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花开花落，云卷云舒
1楼 2014-06-12 12:39:37
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wangxueflower

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by for5 at 2014-06-12 14:37:08
分子量小就用浓度大点的胶，电压要看你胶转膜的大小。分子量小转膜会比较好转，理论上时间有点长，具体借鉴一下预染marker的情况。为确保wb没问题。做个内参吧
...

我用过15%的胶，也都试过交联度为3和5的，用100V 电压，结果电泳跑大约一个小时后就显示error,自动停止了。我用的是biorad 的电泳仪，你在做实验的时候有没有出现这种问题啊，还是我们的电泳仪有问题？
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花开花落，云卷云舒
4楼2014-06-12 15:59:45
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wangxueflower

木虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by FATVICKY at 2014-06-12 16:32:23
我们用的电泳仪出现那种问题，一般是插头接触不好，需要你重新弄一下，还有就是两块板之间的电泳液少了，也会自动断电报错。。...

谢谢啊
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花开花落，云卷云舒
6楼2014-06-13 10:04:46
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wangxueflower

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by pengchenping at 2014-07-07 21:41:15
貌似15％的分离胶分辨不出4kda的吧，多半跑出去啦。
...

那应该用多大的呢

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花开花落，云卷云舒
8楼2014-07-07 22:06:56
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wangxueflower

木虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-08 00:08:09
我刚又看了一下楼主的帖子，补充一些提示。

我上面是说的是针对SDS PAGE的，下面也提示一些小分子多肽转膜的注意几点：
1.小于10KD的分离胶用15%-20%，分离胶太稀，阻滞不了小肽，电泳完了，小肽也跑没有了；
...

谢谢啦，给了这么多好的建议，我想问下，小肽转膜时是不是有转过的现象啊，我也请教过其他人，有人说膜只是起到吸收的作用，一般不会透转的，您怎么看呢？
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花开花落，云卷云舒
16楼2014-07-08 08:50:44
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wangxueflower

木虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-08 00:48:43
SDS-PAGE electrophoresis一般上样体积为10-15μL（即2-10μg蛋白质），当然不同的人的操作可能上样量差异较大。

上样是不是有点少啊，内参的话没问题，一些表达量少的蛋白质2-10ug 好像有点少了，像我现在的一个蛋白质的剪切产物，10ug 估计不可以吧
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花开花落，云卷云舒
18楼2014-07-08 12:28:25
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