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wangxueflower

木虫 (小有名气)

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[交流] 想检测一个大约4kD 的小肽片段，western blot 一直没有条带怎么办已有6人参与

最近一直在做一个4kD小肽片段的western, 试过一般的SDS-Page,也尝试过tricine-SDS-page, 但是一直检测不到条带，
很是郁闷啊，这个小肽是一个前体蛋白经过酶切后的产物。我用的抗体也是一般常用的特异性抗体。上样量是30ug/孔。
是不是上样量太少的原因啊? 还有是不是因为这个小肽的产量不高？转膜方面，我用的是100V 冰上转膜一个半小时，是不是转过了？

请虫友们给点建议吧

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花开花落，云卷云舒

1楼 2014-06-12 12:39:37

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

凌波丽

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专业: 生物大分子结构与功能
管辖: 生物科学综合

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
youlinglyw: 金币+5, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-07-08 10:46:18

我刚又看了一下楼主的帖子，补充一些提示。

我上面是说的是针对SDS PAGE的，下面也提示一些小分子多肽转膜的注意几点：
1.小于10KD的分离胶用15%-20%，分离胶太稀，阻滞不了小肽，电泳完了，小肽也跑没有了；
2.转移buffer中加入终浓度为20%的甲醇；
3.转膜时间适当短一些，你对于4KD肽转了90分钟，时间过了，一般中等蛋白质电转膜时，60-80V也就是60-90min，你该把电压降低，而且时间太过了，就是分离胶浓度够大，SDS-PAGE成功，带你转膜时，小肽可能也跑没有了。