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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 免疫沉淀后进行western blot 应该有几条带？
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 免疫沉淀后进行western blot 应该有几条带？

大家好！我先利用我目的蛋白的一抗进行免疫沉淀，离心取沉淀后加5*loading buffer，煮沸5min后上样，然后进行常规的western blot，用的是与免疫沉淀时一样的抗体，请问这时候ECL曝光应该有几条带？谢谢！
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砖石王老三！！！
1楼 2013-05-22 11:30:21
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回帖置顶 ( 共有2个 )

nixilu110

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2013-05-22 21:39:47
理论上肯定只有一条带，因为只有一种蛋白。 但由于抗体的特异性不强等原因，或许有多条带的出现的
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冷风吹我醒
5楼2013-05-22 19:06:17
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8601

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 谢谢分享经验 2013-05-27 08:39:42
silicare: BioEPI+1 2013-05-27 11:03:29
不会只有一条带的。
除了你要检测的蛋白以外，还会有抗体带。一条在50KD，另一条在25KD。是免疫沉淀时加入的抗体在95度加热后的分解产物，可以被二抗识别。这两条带是很强的。如果你检测的蛋白的大小在这附近你就要注意了。有的二抗识别变性的一抗的能力稍低，那抗体带就会弱些，可以选用。
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6楼2013-05-23 12:45:47
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普通回帖

会思想的芦苇

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-05-22 21:39:44
wizardfan: 金币+2, 应助指数-1, 精神鼓励，不过本人已经在4楼确认回答不正确了 2013-05-24 08:02:31
理论上一条带啊   因为抗体与抗体之间没有反应
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2楼2013-05-22 14:44:57
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 会思想的芦苇 at 2013-05-22 14:44:57
理论上一条带啊   因为抗体与抗体之间没有反应

但是抗体的IgG会与二抗反应反应，显色也是会出来的。
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砖石王老三！！！
3楼2013-05-22 15:38:08
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会思想的芦苇

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jack6335 at 2013-05-22 15:38:08
但是抗体的IgG会与二抗反应反应，显色也是会出来的。...

哦 学习了 我是菜鸟
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4楼2013-05-22 15:45:57
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生物小通

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-05-27 08:39:54
赞同6楼的说法，你可以选用不同的二抗降低对你结果的影响，比如选择二抗只抗重链的，也就是基本上在50kDa和你目的蛋白出出现条带，当然，如果有抗IgG空间结构的二抗自然更好了，只不过我没看到过这种二抗，有也是非常贵的，有的话就只会显示目的条带了。
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学习，进步
7楼2013-05-23 19:43:11
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8601

金虫 (小有名气)
★
wizardfan: 金币+1, 谢谢补充说明 2013-05-27 08:40:13
silicare: 度娘一下蛋白A 2013-05-27 11:06:29
引用回帖:
7楼: Originally posted by 生物小通 at 2013-05-23 05:43:11
赞同6楼的说法，你可以选用不同的二抗降低对你结果的影响，比如选择二抗只抗重链的，也就是基本上在50kDa和你目的蛋白出出现条带，当然，如果有抗IgG空间结构的二抗自然更好了，只不过我没看到过这种二抗，有也是非 ...

我们实验室有一种二抗叫 conjugated proteinA. 这种抗体据老板说只识别有活性的抗体不识别变性的。但我做实验的经验是如果免疫沉淀时放的抗体比较多，还是会识别的，但确实要比一般的弱些。
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8楼2013-05-24 01:02:37
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 生物小通 at 2013-05-23 19:43:11
赞同6楼的说法，你可以选用不同的二抗降低对你结果的影响，比如选择二抗只抗重链的，也就是基本上在50kDa和你目的蛋白出出现条带，当然，如果有抗IgG空间结构的二抗自然更好了，只不过我没看到过这种二抗，有也是非 ...

我做的抗体对照在WB之后就只有50kD处有带，你太牛了！
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砖石王老三！！！
9楼2013-05-26 10:48:09
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jack6335

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 8601 at 2013-05-24 01:02:37
我们实验室有一种二抗叫 conjugated proteinA. 这种抗体据老板说只识别有活性的抗体不识别变性的。但我做实验的经验是如果免疫沉淀时放的抗体比较多，还是会识别的，但确实要比一般的弱些。...

为了回复帖子凌晨还不休息，多谢多谢啊
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砖石王老三！！！
10楼2013-05-26 10:50:26
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