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痴梦潇湘

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[交流] 值得精读的一篇国内发表的Nature Chemical Biology已有27人参与

国内参与单位：国家生命科学研究所、天津大学
这篇文章确证了死亡受体DR5作为抗肿瘤靶标，并筛选出第一个小分子先导化合物，贡献很大，篇幅较短，覆盖当代生物化学各种技术，非常值得精读。文章内容及背景大体如下：
细胞凋亡（apoptosis）有三条信号通路，即：死亡受体信号通路、线粒体信号通路、内质网信号通路，其中第一条为外源性信号通路（extrinsic pathway），后两条为内源性信号通路（intrinsic pathway）。
图1. 细胞凋亡信号通路

图2. 死亡受体信号通路

死亡受体（death receptors）是一种跨膜蛋白，有TNF受体、FasL受体、DR三大类，其胞外区（extracellular domain）与相应的配体结合后，聚合形成同源三聚体。三聚体复合物通过其胞内的死亡结构域（death domain），与衔接蛋白（adaptor protein）FADD结合。FADD一种连接蛋白，C-端为死亡结构域，N-端为死亡效应结构域（death-effector domain），能够与Caspase-8结合，形成死亡诱导信号复合体（death-inducing signaling complex，DISC）。
TNF：tumor necrosis factor，肿瘤坏死因子
FasL：Fas ligand，Fas抗原配体
TRAIL：tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体
FADD：Fas-associated death domain，Fas相关死亡结构域
FasL受体被称为Fas或CD95；TNF受体有两种亚型即TNFR-1和TNFR-2，其中TNFR-1有FADD而TNFR-2没有；DR有三种亚型，其中DR-3被称为Apo-3，DR-4即TRAILR-1，DR-5即TRAILR-2。
Caspase是一组存在于细胞质中的蛋白酶，全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键。活化的Caspase-8可激活下游的Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，激活细胞凋亡下游信号通路。
Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7的活性受到IAP家族蛋白（如XIAP、cIAP1、cIAP2）的抑制，而解除IAP的抑制依赖线粒体的凋亡信号Smac/Diablo。Smac能与IAP的Bir-结构域结合，解除IAP对Caspase的抑制作用，并诱导IAP的降解。
IAP：inhibitor of apoptosis protein细胞凋亡抑制蛋白
Smac与IAP结合的关键是N-端的丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸四个氨基酸残基，科学家已经用肽模拟方法（peptido-mimetic approach）开发出小分子化合物，产生与Smac相似的活性，诱导细胞凋亡。
研究人员筛选了200,000个化合物，寻找能与Smac模拟物（Smac mimetic, SM）产生协同作用的化合物（synergist），筛选用细胞为T98G细胞株（人胶质瘤细胞株）。初筛发现2,068化合物，随后发现24个化合物能在15μΜ浓度显著增强SM抑制肿瘤的活性。删去细胞毒性大的，只剩下4个化合物，做dose-response分析，最终筛选出化合物A2C2作进一步研究。
图3. 发现死亡受体激动剂

按照A2C2的结构，研究人员合成了这一化合物，但奇怪的是合成出的化合物（记为A1）完全没有活性，意味着A1与A2C2不是同一种物质，问题出在哪呢？经过大量NMR和LC/MS分析，确证A2C2实为三种重排产物（A1、C2、A2）的混合物，有活性的是A2+C2。随后是一系列结构修饰合成，发现化合物bioymifi有很好的活性，抑制肿瘤细胞不需要SM的协同作用，并且对多个肿瘤细胞株有抑制活性，下一步就是寻找bioymifi的作用靶点了。
在给予bioymifi和SM的同时，给予pan-caspase抑制剂Z-VAD（Z-VAD能抑制Caspase的活性，阻断细胞凋亡信号通路），发现不能有效抑制肿瘤，这说明bioymifi激活了细胞凋亡信号通路。为了进一步确定bioymifi作用于哪一条信号通路，研究人员使用siRNA分别沉默T98G细胞的Caspase-8和Caspase-9编码区，最终确定bioymifi和SM抑制的是Caspase-8所在信号通路即外源凋亡信号通路。
与Caspase-8有关的死亡受体有Fas、TNFR-1、DR3、DR4、DR5等类型（注TNFR-2无FADD，参与NF-κB诱导细胞凋亡，不经Caspase-8），bioymifi与那种死亡受体有关呢？通过RNAi筛选，沉默DR5基因，能够逆转bioymifi诱导的凋亡，并且bioymifi显示出的结果与TRAIL（DR5的原始配体）一致。
随后的免疫沉淀（immunoprecipitate）和免疫印迹分析（western blot analysis）证实，bioymifi或TRAIL处理后的T98G细胞中，均检测到FADD、TRADD、RIPK1等与DISC相关的蛋白，而对照细胞检测不到。
另一方面，给予TRAIL的同时给予TRAIL抗体，TRAIL失去诱导细胞凋亡的能力。给予TRAIL的同时给予bioymifi，诱导细胞凋亡能力无明显差异。沉默用siRNA沉默TRAIL基因，不影响bioymifi诱导细胞凋亡的能力。
为了进一步确证bioymifi的作用靶点，研究人员仅含胞外区的DR4与DR5，发现bioymifi与DR5的亲和力较好，Kd值在1.2μΜ，与DR4无亲和力。DSD电泳、分子排阻色谱等检测到高分子量的聚合物，证明bioymifi能诱导DR5的聚合，细胞成像也观察到了明显的foci 结构，DR4无这些现象。
综上，发现了第一个选择性小分子DR5激动剂。
Reference: Small-molecule activation of the TRAIL receptor DR5 in human cancer cells. Nature Chemical Biology. doi:10.1038/nchembio.1153.

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