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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒是PCR产物，片段是磷酸化的，易自连，求连接体系中二者的比例，希望高手指点
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liuyil

银虫 (小有名气)

[求助] 质粒是PCR产物，片段是磷酸化的，易自连，求连接体系中二者的比例，希望高手指点 已有5人参与

大家好，最近做连接转化，我想请教大家一个问题，我现在的质粒是1700 bp,自己构建的，PCR产物，两端都是-OH，不会自连；而插入的片段是大小不等的片段，大小在200-2000 bp，现在准备做连接，基于质粒不会自连，片段易自连，而且大小差距不大，我打算将载体浓度提高，为载体：目的片段=5:1和10:1，主要是想把载体质粒连接上去，不然全是片段的自连，不知道可行不？谢谢前辈指点
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未来不知道会怎么样，做好当下最重要。
1楼 2014-06-03 17:42:20
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般的情况载体：片段（摩尔比）=1：5.
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我不会！
5楼2014-06-04 14:11:31
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杰-米尼

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuyil: 金币+1 2014-06-04 20:29:34
liuyil: 金币+1, ★有帮助 2014-06-11 13:03:39
我们这里一般载体和片段的摩尔比是1:3—3:1这个范围，最常用的是1:3
你的载体有抗性吗？要是有抗性的话片段自连也无所谓的
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做科研还是需要好的逻辑能力的 加油
6楼2014-06-04 16:17:47
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meng_xu

铜虫 (小有名气)
你筛选的标识在载体上还是在你的片段上？如果你片段上没有抗性，自连怕什么？

转化之后，一切自然解决
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8楼2014-06-05 05:38:03
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a50044758

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuyil: 金币+1 2014-08-19 11:32:44
你的想法可行，做吧～！摩尔比建议从1：1到10：1做个梯度。
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9楼2014-06-06 17:40:15
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

PCR产物电泳回收，纯化你要的片段，再连接
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10楼2014-06-09 09:28:59
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普通回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuyil(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-03 18:39:06
liuyil: 金币+1 2014-06-04 20:27:59
摩尔比计算好就不会有什么问题，片段和质粒的大小差别太大就会连不上，其他应该不会出现什么问题，祝顺
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
2楼2014-06-03 17:53:45
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liuyil

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 475502411 at 2014-06-03 10:53:45
摩尔比计算好就不会有什么问题，片段和质粒的大小差别太大就会连不上，其他应该不会出现什么问题，祝顺

就是我的片段和质粒大小差别不大，都是平末端，质粒是PCR产物，两端是-OH，片段是大小不等的200-2000bp的小片段（磷酸化处理的），我想提高质粒的浓度，一般要求片段浓度高，我担心片段自连严重
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未来不知道会怎么样，做好当下最重要。
3楼2014-06-03 18:28:15
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liuyil

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 475502411 at 2014-06-03 10:53:45
摩尔比计算好就不会有什么问题，片段和质粒的大小差别太大就会连不上，其他应该不会出现什么问题，祝顺

不知道质粒浓度比片段浓度高有什么影响呢？
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未来不知道会怎么样，做好当下最重要。
4楼2014-06-03 18:28:37
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liuyil

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 杰-米尼 at 2014-06-04 09:17:47
我们这里一般载体和片段的摩尔比是1:3—3:1这个范围，最常用的是1:3
你的载体有抗性吗？要是有抗性的话片段自连也无所谓的

我的载体有抗性的，而且是脱磷酸化的，不会自连，只是我的片段容易自连。
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未来不知道会怎么样，做好当下最重要。
7楼2014-06-04 20:29:25
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