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liuyil

银虫 (小有名气)

[求助] 质粒是PCR产物,片段是磷酸化的,易自连,求连接体系中二者的比例,希望高手指点 已有5人参与

大家好,最近做连接转化,我想请教大家一个问题,我现在的质粒是1700 bp,自己构建的,PCR产物,两端都是-OH,不会自连;而插入的片段是大小不等的片段,大小在200-2000 bp,现在准备做连接,基于质粒不会自连,片段易自连,而且大小差距不大,我打算将载体浓度提高,为载体:目的片段=5:1和10:1,主要是想把载体质粒连接上去,不然全是片段的自连,不知道可行不?谢谢前辈指点
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未来不知道会怎么样,做好当下最重要。
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

你筛选的标识在载体上还是在你的片段上?如果你片段上没有抗性,自连怕什么?

转化之后,一切自然解决
8楼2014-06-05 05:38:03
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查看全部 11 个回答

475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
liuyil(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-03 18:39:06
liuyil: 金币+1 2014-06-04 20:27:59
摩尔比计算好就不会有什么问题,片段和质粒的大小差别太大就会连不上,其他应该不会出现什么问题,祝顺
可以朝九晚五,也能浪迹天涯
2楼2014-06-03 17:53:45
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liuyil

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 475502411 at 2014-06-03 10:53:45
摩尔比计算好就不会有什么问题,片段和质粒的大小差别太大就会连不上,其他应该不会出现什么问题,祝顺

就是我的片段和质粒大小差别不大,都是平末端,质粒是PCR产物,两端是-OH,片段是大小不等的200-2000bp的小片段(磷酸化处理的),我想提高质粒的浓度,一般要求片段浓度高,我担心片段自连严重
未来不知道会怎么样,做好当下最重要。
3楼2014-06-03 18:28:15
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liuyil

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 475502411 at 2014-06-03 10:53:45
摩尔比计算好就不会有什么问题,片段和质粒的大小差别太大就会连不上,其他应该不会出现什么问题,祝顺

不知道质粒浓度比片段浓度高有什么影响呢?
未来不知道会怎么样,做好当下最重要。
4楼2014-06-03 18:28:37
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